S8APO徠卡顯微鏡的分辨率如何計(jì)算？

S8APO徠卡顯微鏡的分辨率如何計(jì)算？

S8APO徠卡顯微鏡的分辨率如何計(jì)算？

S8APO徠卡顯微鏡的分辨率如何計(jì)算？

在顯微術(shù)中，術(shù)語“分辨率”用于描述顯微鏡區(qū)分細(xì)節(jié)的能力。換句話說，這是通過觀察者或顯微鏡攝像機(jī)仍然可以看到樣本的兩個(gè)不同點(diǎn)的小距離 - 作為單的實(shí)體。

顯微鏡的分辨率與光學(xué)部件的數(shù)值孔徑（NA）以及用于檢查樣品的光的波長(zhǎng)本質(zhì)上相關(guān)。此外，我們必須考慮由恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）于1873年描述的衍射極限。

本文涵蓋了這些概念背后的一些歷史，并解釋每個(gè)使用相對(duì)簡(jiǎn)單的術(shù)語。

分辨率和數(shù)值孔徑

數(shù)字孔徑（NA）與光通過的介質(zhì)的折射率（n）以及給定物鏡（NA = n x sinα）的角孔徑（α）有關(guān)。顯微鏡的分辨率不僅僅取決于物鏡的NA，而是考慮到顯微鏡聚光鏡的NA，整個(gè)系統(tǒng)的NA。更多的圖像細(xì)節(jié)將在其中所有光學(xué)部件正確對(duì)準(zhǔn)，具有相對(duì)較高的NA值并且彼此協(xié)調(diào)工作的顯微鏡系統(tǒng)中被解決。分辨率也與用于對(duì)樣本成像的光的波長(zhǎng)有關(guān); 較短波長(zhǎng)的光能夠比較長(zhǎng)的波長(zhǎng)分辨更多的細(xì)節(jié)。

在處理決議時(shí)需要考慮三個(gè)數(shù)學(xué)概念：“阿貝衍射極限”，“艾里光盤”和“瑞士標(biāo)準(zhǔn)”。這些都按時(shí)間順序列在下面。

喬治·比德爾·艾利和“艾利斑”（1835）

喬治·比德爾·艾利（George Biddell Airy 1801-1892）是英數(shù)學(xué)家和天文學(xué)家。到1826年（25歲），他被任命為三一學(xué)院數(shù)學(xué)教授，兩年后，他被任命為新劍橋天文臺(tái)的天文教授。從1835年到1881年，他是“天文學(xué)家*”，他有一個(gè)月球和火星火山口以他的榮譽(yù)命名。

同樣在1835年，他在劍橋哲學(xué)社會(huì)交易會(huì)上發(fā)表了一篇題為“關(guān)于圓形玻璃的衍射”的論文。艾里從天文學(xué)家的角度非常地寫了這篇文章，他描述了“在一個(gè)好的望遠(yuǎn)鏡上看到的星星的形象和光線的形狀和亮度”。盡管在不同的科學(xué)域?qū)懽?，但這些觀察結(jié)果與其他光學(xué)系統(tǒng)和顯微鏡相關(guān)

的艾里斑是可以通過一個(gè)圓形孔在通過衍射限制的*對(duì)準(zhǔn)的系統(tǒng)來確定的光的佳聚焦點(diǎn)。從上圖（圖1）可以看出，這是一個(gè)亮點(diǎn)，它們是同心環(huán)或波紋（更準(zhǔn)確地稱為通氣圖案）。

衍射圖案由光的波長(zhǎng)和光通過的孔的大小確定。Airy Disc的中心點(diǎn)包含大約84％的發(fā)光強(qiáng)度，其余16％在衍射圖案周圍。當(dāng)然，用顯微鏡觀察到的樣本中有許多光線，而且像“Airy Disc”一詞所描述的那樣，更適合多種艾里模式而不是單點(diǎn)光。

如圖1下半部分所示的艾里模式的三維表示也稱為“點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)”。

恩斯特·阿貝和“阿貝的衍射極限”（1873）

恩斯特·卡爾·阿貝（Ernst·Karl·Abbe 1840-1905年）是德數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家，1866年，他遇到卡爾·蔡司，并共同創(chuàng)立了所謂的“蔡司光學(xué)工程”，現(xiàn)在被稱為蔡司。此外，他還于1884年共同創(chuàng)立了Schott Glassworks。阿貝也是*個(gè)定義術(shù)語數(shù)值孔徑的人。1873年，阿貝出版了他的理論和公式，解釋了顯微鏡的衍射極限。阿貝認(rèn)識(shí)到標(biāo)本圖像由多個(gè)重疊的多重強(qiáng)度的衍射極限點(diǎn)（或艾里版）組成。

為了提高分辨率（d =λ/ 2 NA），必須使用較短波長(zhǎng)（λ）光或通過具有較高折射率的成像介質(zhì)或具有高NA的光學(xué)部件（或，實(shí)際上是所有這些因素的組合）。

然而，即使考慮到所有這些因素，由于整個(gè)系統(tǒng)的復(fù)雜性，波長(zhǎng)在400nm以下的玻璃的傳輸特性以及在完整的波長(zhǎng)下達(dá)到高的NA，實(shí)際顯微鏡系統(tǒng)的限制仍然有限制顯微鏡。理想光學(xué)顯微鏡中的橫向分辨率限制在約200nm，而軸向分辨率約為500nm（例如分辨率限制，請(qǐng)參見下文）。

約翰·威廉·斯特拉特和“瑞利標(biāo)準(zhǔn)”（1896）

約翰·威廉·斯特魯特（John William Strutt），3rd Baron Rayleigh（1842-1919）是英物理學(xué)家和多產(chǎn)作家。他在一生中寫了驚人的466篇出版物，其中包括430篇科學(xué)論文。他寫了一系列廣泛的主題，如鳥飛，心理研究，聲學(xué)等，并于1895年發(fā)現(xiàn)了氬氣（他于1904年被授予諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)）。

瑞利建立并擴(kuò)大了喬治·艾里的作品，并于1896年發(fā)明了“瑞利標(biāo)準(zhǔn)”的理論。瑞利標(biāo)準(zhǔn)（圖2）定義了衍射受限系統(tǒng)中的分辨率極限，換句話說，當(dāng)兩點(diǎn)光可以區(qū)分或相互分離。

使用艾里光盤的理論，如果來自兩個(gè)單的艾里版光盤的衍射圖案不重疊，則它們很容易區(qū)分，“很好地解決”，據(jù)說符合瑞利標(biāo)準(zhǔn)（圖2，左圖）。當(dāng)一張艾里光盤的中心直接與另一張的衍射圖案的*個(gè)小值重疊時(shí)，它們可以被認(rèn)為是“剛剛解決”，并且仍然可以區(qū)分為兩個(gè)立的光點(diǎn)（圖2，中間）。如果艾里光盤比這更接近，那么它們不符合瑞利標(biāo)準(zhǔn)，并且“未被解析”為兩個(gè)不同的光點(diǎn)（或標(biāo)本圖像中的單細(xì)節(jié);圖2右側(cè)）。

圖2：由兩個(gè)單的艾菲片重疊衍射圖所示的分辨率極限（由瑞利標(biāo)準(zhǔn)定義）：
左：解決中：剛解決右：未解決

如何計(jì)算顯微鏡的分辨率

考慮到上述所有理論，很明顯，在計(jì)算理論分辨率極*，需要考慮許多因素。分辨率也取決于樣本的性質(zhì)。我們來看看使用阿貝的衍射極限計(jì)算分辨率，并使用瑞利標(biāo)準(zhǔn)。

先，應(yīng)該記住：

NA = n x sin α

其中n是成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡 的角孔的一半。物鏡的大角度孔徑約為144º。該角度的一半的正弦為0.95。如果使用折射率為1.52的油的浸沒物鏡，物鏡的大NA將為1.45。如果使用“干式”（非浸沒）物鏡，物鏡的大NA將為0.95（空氣的折射率為1.0）。

橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：

d =λ/ 2 NA

其中λ是用于成像樣品的光的波長(zhǎng)。如果使用514nm的綠光和NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）極限將為177nm。

軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：

d = 2λ/ NA²

再次，如果我們假設(shè)波長(zhǎng)為514nm，以NA值為1.45的物鏡觀察樣品，則軸向分辨率將為488nm。

瑞利標(biāo)準(zhǔn)是基于阿貝的衍射極限的一個(gè)略微改進(jìn)的公式：

R =1.22λ/ NAobj + NAcond

其中λ是用于成像樣品的光的波長(zhǎng)。NAobj是物鏡的NA。NAcond是聚光鏡的NA。“1.22”的數(shù)字是一個(gè)常數(shù)。這是從瑞利關(guān)于貝塞爾功能的工作得出的。這些用于計(jì)算諸如波傳播的系統(tǒng)中的問題。

考慮到聚光鏡的NA，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和載玻片之間的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的角度孔徑為144°，則NAcond值將等于0.95。

如果使用514nm的綠光，NA為1.45的油浸物鏡，NA為0.95的聚光鏡，則（理論）分辨率極限為261nm。

如上所述，用于對(duì)樣本進(jìn)行成像的光的波長(zhǎng)越短，則將更多的細(xì)節(jié)被解決。因此，如果使用400nm光的短可見波長(zhǎng)，使用NA為1.45的油浸物鏡和NA為0.95的聚光鏡，則R將等于203nm。

為了在顯微鏡系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)大（理論）分辨率，每個(gè)光學(xué)部件應(yīng)該具有高的NA可用（考慮角度孔徑）。此外，使用較短波長(zhǎng)的光來觀察樣品會(huì)增加分辨率。后，整個(gè)顯微鏡系統(tǒng)應(yīng)該正確對(duì)齊。