Lumina熒光光度計(jì)儀器參數(shù)設(shè)定

簡(jiǎn)介

在室溫下分子大都處在基態(tài)的zui低振動(dòng)能級(jí)，當(dāng)受到光的照射時(shí)，便吸收與它的特征頻率相一致的光線，其中某些電子由原來(lái)的基態(tài)能級(jí)躍遷到*電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)中的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，這就是在分光光度法中所述的吸光現(xiàn)象。躍遷到較高能級(jí)的分子，很快通過(guò)振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換等方式釋放能量后下降到*電子激發(fā)態(tài)的zui低振動(dòng)能級(jí)，能量的這種轉(zhuǎn)移形式，稱為*躍遷。再由*電子激發(fā)態(tài)的zui低振動(dòng)能級(jí)下降到基態(tài)的任何振動(dòng)能級(jí)，并以光的形式放出它們所吸收的能量，這種光便稱為熒光。

圖 1. 熒光機(jī)理（Jablonski 圖）熒光分析法是測(cè)定物質(zhì)吸收了一定頻率的光以后，物質(zhì)本身所發(fā)射的光的強(qiáng)度。物質(zhì)吸收的光，稱為激發(fā)光。物質(zhì)所發(fā)射的光，稱為發(fā)射光或熒光。如果將激發(fā)光用單色器分光后，連續(xù)測(cè)定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度所得到的光譜，被稱為該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。選取激發(fā)光譜中zui大吸收峰處的波長(zhǎng)，固定波長(zhǎng)檢測(cè)物質(zhì)所發(fā)射的熒光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，所得到的曲線稱為該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射光譜是熒光物質(zhì)定性的依據(jù)。對(duì)于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定波長(zhǎng)和一定強(qiáng)度的入射光照射下，當(dāng)液層的厚度不變時(shí)，所發(fā)生的熒光強(qiáng)度和該溶液的濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎(chǔ)。為獲得*數(shù)據(jù)，儀器參數(shù)的設(shè)定尤其重要。在本技術(shù)指南中，對(duì)Lumina儀器參數(shù)的含義進(jìn)行說(shuō)明，同時(shí)說(shuō)明設(shè)定值變更和熒光光譜變化之間的相關(guān)性。

儀器參數(shù)

PMT：光電倍增管電壓，可增加熒光強(qiáng)度。PMT的設(shè)定值越高，熒光強(qiáng)度就越高，不過(guò)噪聲信號(hào)也會(huì)增加；因此，可根據(jù)樣品適當(dāng)調(diào)整。狹縫：可調(diào)整光束寬度，光束寬度越寬，到達(dá)樣品的光束越多，熒光強(qiáng)度也會(huì)增加。發(fā)射波長(zhǎng)間隔：檢測(cè)樣品時(shí)，可設(shè)定波長(zhǎng)間隔。如設(shè)定為0.1nm，光束的照射密度會(huì)很密，會(huì)使檢測(cè)時(shí)間變長(zhǎng)。積分時(shí)間：檢測(cè)樣品時(shí)按照波長(zhǎng)間隔向樣品照射光束的時(shí)間。假設(shè)在400～600nm范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)射掃描，積分時(shí)間為20ms，如將間隔設(shè)為0.1nm，熒光檢測(cè)步驟如下：400nm波長(zhǎng)下，照射20ms；400.1nm波長(zhǎng)下，照射20ms；400.2nm波長(zhǎng)下，照射20ms。也就是說(shuō)，隨著積分時(shí)間的增加，在各波長(zhǎng)下照射光束的時(shí)間也會(huì)增加，使得掃描速率 (nm/min) 變慢，熒光強(qiáng)度增加。

標(biāo)準(zhǔn)樣品：

•熒光素 (3×10^-6 M)

上述參數(shù)可根據(jù)樣品進(jìn)行調(diào)整。

圖 2. 熒光素的分子結(jié)構(gòu)

•蒽 (1×10-5 M)

圖 2. 熒光素的分子結(jié)構(gòu)

2.Lumina熒光分光計(jì)

3.Luminous軟件

4.熒光比色皿（光程 10 mm）

實(shí)驗(yàn)步驟

按照*的儀表參數(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品（熒光素、蒽）進(jìn)行檢測(cè)后，邊更改儀表參數(shù)設(shè)定，邊確認(rèn)熒光光譜的變化。

1.檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的激發(fā)、發(fā)射光譜

2.檢測(cè)不同PMT值下的發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度變化

3.檢測(cè)不同狹縫值下的發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度變化

4.檢測(cè)不同積分時(shí)間值下的發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度和掃描速率變化

5.檢測(cè)不同發(fā)射波長(zhǎng)間隔對(duì)掃描速率和熒光光譜的影響

6.檢測(cè)不同掃描速率對(duì)光譜的影響

7.檢測(cè)不同響應(yīng)時(shí)間對(duì)光譜的影響

結(jié)果

1.標(biāo)準(zhǔn)樣品的激發(fā)、發(fā)射光譜

圖4為按照?qǐng)D5所示儀表參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)的熒光素激發(fā)、發(fā)射光譜。

圖 4. 熒光素 3×10^-6  M 的激發(fā)光譜（紅色）和發(fā)射光譜（黑色）

圖 5. 儀器參數(shù)設(shè)置

2.不同PMT 值對(duì)發(fā)射光譜的影響

如圖6所示，隨著熒光素PMT電壓的增加，熒光強(qiáng)度會(huì)增加。

圖7為不同狹縫寬度下熒光強(qiáng)度的變化。通過(guò)狹縫寬度的變更，可調(diào)整激發(fā)光和放射光的量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看出變更狹縫寬度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響大于變更PMT值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。e="宋體" >電壓的增加，熒光強(qiáng)度會(huì)增加。

圖 7.不同狹縫寬度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

4.不同積分時(shí)間對(duì)發(fā)射光譜及掃描速度的影響增加積分時(shí)間，即增加光束照射樣品的時(shí)間，發(fā)射光強(qiáng)度會(huì)增加，還可確認(rèn)熒光掃描速率也會(huì)發(fā)生變化。

圖 8. 不同積分時(shí)間下的熒光強(qiáng)度及掃描速率值的變化

5.不同發(fā)射波長(zhǎng)間隔下發(fā)射光譜的變化Lumina的熒光光譜掃描速度設(shè)置為用戶自定義時(shí)，積分時(shí)間、平均數(shù)、掃描間隔可以按照自己的意愿進(jìn)行設(shè)定。增加發(fā)射波長(zhǎng)間隔時(shí)，檢測(cè)間隔會(huì)增加，故掃描速率會(huì)加快。當(dāng)掃描速率加快時(shí)，如圖9所示，光譜 FWHM 變寬。

 圖9. 不同發(fā)射波長(zhǎng)間隔時(shí)對(duì)熒光強(qiáng)度及掃描速率值影響

 6.不同掃描速率對(duì)發(fā)射光譜的影響其他參數(shù)不變的情況下，隨著掃描速率的加快，光譜FWHM變寬。

總結(jié)

儀表參數(shù)的設(shè)定會(huì)對(duì)光譜數(shù)據(jù)產(chǎn)生巨大的影響。根據(jù)樣品類型、濃度及純度，儀表參數(shù)的設(shè)定值應(yīng)會(huì)有所不同，檢測(cè)員需根據(jù)樣品類型和狀態(tài)，變更儀表參數(shù)的設(shè)定值，以求獲得*的光譜條件。erun:'yes';font-family:'Times New Roman';" > 其他參數(shù)不變的情況下，隨著掃描速率的加快，光譜FWHM變寬。