DNA載體構(gòu)建——【干貨】三圖讓你秒懂質(zhì)粒圖譜

很多人拿到一個(gè)質(zhì)粒圖譜，第一反應(yīng)只能是仰天長(zhǎng)嘯，這是什么玩意？這些 ori、RBS、tet 是什么鬼？這些箭頭代表什么，轉(zhuǎn)錄的方向嗎？為什么都不相同，不會(huì)“撞車(chē)”么？ 來(lái)，看幾張圖，上面的問(wèn)題就能一一破解。

第一步：先了解質(zhì)粒的基本組成元素。

1）復(fù)制起始點(diǎn) Ori。該位點(diǎn)決定了質(zhì)粒的宿主及質(zhì)粒的拷貝數(shù)，它是質(zhì)粒中一段特定序列，富含 AT 和重復(fù)序列。

Tips：圖譜上只有一個(gè) Ori，表示質(zhì)粒是原核克隆表達(dá)質(zhì)粒；有兩個(gè) Ori，則表示該質(zhì)粒是，穿梭質(zhì)粒，即可在原核也可在真核中復(fù)制。

2）抗性篩選基因。圖譜中 Kan/tet 就是抗生素抗性基因，方便后續(xù)通過(guò)抗生素篩選陽(yáng)性克隆。特點(diǎn)就是單詞最后會(huì)以大寫(xiě) R 或上標(biāo) r 結(jié)束。

Tips：一般克隆載體只有一種抗性篩選標(biāo)記，部分表達(dá)載體及穿梭質(zhì)粒具有兩種抗性篩選標(biāo)記。

3）多克隆位點(diǎn)（MCS），即一系列限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，是外源 DNA 插入位點(diǎn)，一般可通過(guò)酶切/連接方式將外源 DNA 插入質(zhì)粒，外源 DNA 一般小于 10kb，而片段越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率越低。

Tips: 一般位于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)之間；所包含的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)數(shù)量和組成因載體不同會(huì)有所差異，且其中的酶切位點(diǎn)在質(zhì)粒中為單一的酶切位點(diǎn)；同時(shí)在使用時(shí)需注意質(zhì)粒載體與外源 DNA 酶切位點(diǎn)的兼容性問(wèn)題熒光標(biāo)記或蛋白標(biāo)簽序列。蛋白純化標(biāo)簽蛋白：His-Tag，GST-Tag 等；蛋白檢測(cè)標(biāo)簽蛋白：Myc-Tag，F(xiàn)lag-Tag，HA-Tag 等；熒光蛋白表達(dá)標(biāo)簽：GFP，mCherry 等。

第二步：看質(zhì)粒是否是表達(dá)載體，如果是，那就必定有這些原件：?jiǎn)?dòng)子－核糖體結(jié)合位 點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。

1、啟動(dòng)子：促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列，可與 RNApol 特異性結(jié)合。

2、增強(qiáng)子/沉默子：前者是真核基因組中一種增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程的調(diào)控順序，其作用與增強(qiáng)子所在位置或方向無(wú)關(guān)。后者是負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。

3、核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

4、轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA  的保守序列，此位點(diǎn) down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這 2 部分共同構(gòu)成 poly（A）加 尾信號(hào)。

第三步：弄清楚方向，即為何質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針而有的箭頭逆時(shí)針。

其實(shí)那是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的某些基因在另一條鏈上。當(dāng)然，最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段（從 T7 啟動(dòng)子到終止子那一段）的方向，即下圖黃色圈圈所示的箭頭方向，其它的大可以忽略。