RNA pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)

RNA pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1. 實(shí)驗(yàn)原理

RNA pull down是體外研究RNA與蛋白互作的重要技術(shù)。該技術(shù)是用生物素標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄的靶RNA分子，再用鏈霉親和素純化出與靶RNA結(jié)合的蛋白復(fù)合體，洗脫得到RNA結(jié)合蛋白質(zhì)。再通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與靶RNA結(jié)合；或通過質(zhì)譜儀檢測可以篩選出與靶RNA結(jié)合的蛋白。

生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度最高的非共價作用；其中活化生物素可以在蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的介導(dǎo)下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯(lián)。因此用生物素標(biāo)記核酸后，可以純化出與該核酸結(jié)合的各種生物大分子復(fù)合物。

2. 實(shí)驗(yàn)流程

1）探針設(shè)計及標(biāo)記：體外轉(zhuǎn)錄或合成獲取RNA，生物素標(biāo)記;

2）pull down：與細(xì)胞裂解液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素磁珠結(jié)合，從而把靶RNA結(jié)合蛋白從細(xì)胞裂解液中分離出來，經(jīng)過洗滌將非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)去除；最后，洗脫得到與靶RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物；

3）互作蛋白質(zhì)鑒定：再經(jīng)過Western Blot（WB）或質(zhì)譜(MS)鑒定蛋白質(zhì)。

3. 服務(wù)內(nèi)容

1）體外轉(zhuǎn)錄或合成RNA，生物素標(biāo)記；

2）細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞裂解液制備；

3）pull down捕獲互作蛋白；

4）Western blot驗(yàn)證互作蛋白；

5）MS篩選鑒定互作蛋白。

4. 交付結(jié)果

1）提供詳細(xì)、完整的實(shí)驗(yàn)報告；

2）客觀公正的原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果。

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