多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點

多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點

分光光度法50管/24樣

注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實軟化，與果實成熟、葉和花的脫落、病原物防御，細(xì)胞伸展發(fā)育以及木質(zhì)化有關(guān)，在植物抗病性和食品貯藏保鮮領(lǐng)域具有較高的研究價值。

測定原理：

多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS試劑反應(yīng)生成紅棕色物質(zhì)，在540nm有特征吸收峰，測定540nm處吸光值變化可計算得多聚半乳糖醛酸酶活性。

自備實驗用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體25mL×1瓶，4℃避光保存。

多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點酶液提取：

1．組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。16000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2．細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后16000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。

3．培養(yǎng)液：直接檢測。

測定操作表：

酶活性計算公式：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 3.9642x - 0.008；R² = 0.9996；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y為吸光值。

1．按照蛋白濃度計算

多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術(shù)要點酶活性定義：

在40℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每克樣本每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3．按液體體積計算

酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)

4. 按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每10⁴個細(xì)胞每小時分解果膠酸產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。

PG活性（mg/h/10⁴cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷細(xì)胞數(shù)量      

V反總：反應(yīng)總體積，0.5mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，0.5h

注意事項：

煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸10分鐘，以將酶*滅活。

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