熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡區(qū)別及特性

熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡不同，它不是通過普通光源的照明觀察標(biāo)本，而是利用定波長(zhǎng)的光(通常是紫外光、藍(lán)紫光)激發(fā)顯微鏡下標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)，使之發(fā)射熒光，所以，熒光顯微鏡的光源所起的作用不是直接照明，而是作為種激發(fā)標(biāo)本的內(nèi)熒光物質(zhì)的能源。我們之所以能觀察標(biāo)本，不是由于光源的照明，而是標(biāo)本內(nèi)熒光物質(zhì)吸收激發(fā)的光能后所呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。由此可知，熒光顯微鏡的特點(diǎn)，主要是它的光源能供給大量特定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)能獲得必要強(qiáng)度的激發(fā)光。同時(shí)，熒光顯微鏡必須具備相應(yīng)的濾光鏡系統(tǒng)。熒光顯微鏡是**熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超壓光源、濾片系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

1.激發(fā)熒光的方式：按光的波長(zhǎng)范圍分為UV激發(fā)法(使用紫外線照明法)和BV激發(fā)法(使用藍(lán)紫光)兩種。UV激發(fā)法是用短于400nm的近紫外光進(jìn)行激發(fā)。該法不存在可見的激發(fā)光，所以被觀察的熒光呈現(xiàn)該染料固有的熒光，容易判別標(biāo)本上的特異熒光和背景組織的自身熒光。

2.BV激發(fā)法：是以404nm、434nm為中心的由紫外至藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。該方法使用藍(lán)光照射標(biāo)本，所以熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用可*阻斷藍(lán)光并可充分通過所需綠、黃熒光的濾光片。用于熒光抗體法的熒光色素。對(duì)于激發(fā)光的大吸收波長(zhǎng)和熒光的大發(fā)光波長(zhǎng)比較接近，所以BV激發(fā)法使用的濾光片必須使用銳截止式濾光片。該法可用藍(lán)光作為激發(fā)光，所以熒光色素的吸收效率較，可得到較明亮的圖像。其缺點(diǎn)是500nm以下的熒光無法看到，而500nm以上的使整個(gè)圖像顯黃色。在熒光抗體法中，大多以熒光色素*的顏色來判斷其特異性，所以在討論微妙的特異性時(shí)，上述BV激發(fā)法的缺點(diǎn)往往影響大。

 熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡光源的區(qū)別

 熒光顯微鏡的光源主要采用氙弧燈或汞燈，但近年來也使用高功率LED作光源，而普通光學(xué)顯微鏡通常只有鹵素或LED燈來照明。熒光顯微鏡的照明方式一般是用落射式，也就是說光源是通過物鏡來投放于試驗(yàn)樣本上，而普通光學(xué)顯微鏡是直接用光源照射樣品，從而進(jìn)行的觀察。在分辨率上講，熒光顯微鏡利用的是紫外線光源，波長(zhǎng)比較短，但是分辨率卻高于普通的光學(xué)顯微鏡。在濾光片的使用上，熒光顯微鏡是用了兩個(gè)特殊的濾光片，在光源前的作用是用來濾出可見光，在物鏡和目鏡之間的作用是用來濾出紫外線，以保護(hù)觀察者的眼睛。熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別大致就是這些。

熒光顯微鏡工作原理

多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀*蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

1．激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。

 紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號(hào)為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號(hào)為QB24（BG12）。

 最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍(lán)綠濾板（如B-7）激發(fā)。