大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌中的代表種類，多次爆發(fā)，造成了重大的經濟損失，因此，該菌在食品安全等方面具有重要的研究意義。本文締一生物為您介紹常規(guī)培養(yǎng)法檢測大腸埃希氏菌O157：H7/NM操作步驟如下：

1增菌

以無菌操作取檢樣25g(或25mL)加入到含有225mL mEC+新生霉素肉湯的均質袋中，在拍擊式均質器上連續(xù)均質1min~2min;或放入盛有225mL mEC+新生霉素肉湯的均質杯中，8000r/min~10000r/min均質1min~2min。36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。

2分離

取增菌后的mEC+新生霉素肉湯，劃線接種于CT-SMAC平板和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上，36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，觀察菌落形態(tài)。在CT-SMAC平板上，典型菌落為圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;在大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上的菌落特征按產品說明書進行判定。

締一生物為您推薦一款CT-SMAC平板，國際上HiMedia公司生產的，大腸桿菌O157：H7顯色培養(yǎng)基（貨號：M1340），又名為麥康凱山梨醇培養(yǎng)基，是用于從食物和動物飼料中選擇性分離大腸桿菌O157:H7。培養(yǎng)基中含有山梨醇。大腸菌群如肺鹽克雷伯菌發(fā)酵山梨醇，產生粉紅色菌落，大腸桿菌O157:H7不發(fā)酵山梨醇，為無色菌落。普通大腸桿菌則被鑒別為藍綠色，大多數(shù)革蘭氏陽性菌被結晶紫和膽鹽抑制。

本品還有化學限定培養(yǎng)基可選，有效避免患瘋牛病的風險。符合國標GB4789.36—2016大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗CT-SMAC平板試劑規(guī)定。HiMedia公司生產的培養(yǎng)基生產均通過了ISO9001、ISO13485、WHO-GMP認證和CE認證，產品質量有保障。

3初步生化試驗

在CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂平板上分別挑取5個~10個可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時接種MUG-LST肉湯，并用大腸埃希氏菌株(ATCC25922或等效標準菌株)做陽性對照和大腸埃希氏菌O157:H7(NCTC12900或等效標準菌株)做陰性對照，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。必要時進行氧化酶試驗和革蘭氏染色。

在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈黃色，產氣或不產氣，不產生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長波紫外燈下觀察，MUG陽性的大腸埃希氏菌株應有熒光產生，MUG陰性的應無熒光產生，大腸埃希氏菌O157:H7/NM為MUG試驗陰性，無熒光。挑取可疑菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，并進行下列鑒定。

4鑒定

4.1血清學試驗

在營養(yǎng)瓊脂平板上挑取分純的菌落，用O157和H7診斷血清或O157乳膠凝集試劑作玻片凝集試驗。對于H7因子血清不凝集者，應穿刺接種半固體瓊脂，檢查動力，經連續(xù)傳代3次，動力試驗均陰性，確定為無動力株。如使用不同公司生產的診斷血清或乳膠凝集試劑，應按照產品說明書進行。

4.2生化試驗

4.2.1自營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，進行生化試驗。大腸埃希氏菌O157:H7/NM生化反應特征見表1。

4.2.2如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)，應從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取菌落，用稀釋液制備成濁度適當?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

4.3毒力基因測定(可選項目)

樣品中檢出大腸埃希氏菌O157:H7或O157:NM時，如需要進一步檢測Vero細胞毒素基因的存在，可通過接種Vero細胞或HeLa細胞，觀察細胞病變進行判定;也可使用基因探針檢測或聚合酶鏈反應(PCR)方法進行志賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly等基因的檢測。如使用試劑盒檢測上述基因，應按照產品的說明書進行。

HiMedia公司檢測大腸埃希氏菌O157：H7/NM可用產品：

4.3毒力基因測定(可選項目)

樣品中檢出大腸埃希氏菌O157:H7或O157:NM時，如需要進一步檢測Vero細胞毒素基因的存在，可通過接種Vero細胞或HeLa細胞，觀察細胞病變進行判定;也可使用基因探針檢測或聚合酶鏈反應(PCR)方法進行志賀毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly等基因的檢測。如使用試劑盒檢測上述基因，應按照產品的說明書進行