熒光原位雜交技術(shù)攻略

1.熒光原位雜交概念

熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一種非放射性原位雜交技術(shù)，同時也是一種新型的分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)相結(jié)合的技術(shù)。熒光原位雜交技術(shù)是利用熒光檢測系統(tǒng)對DNA進行定性、定量或相對定位分析的技術(shù)，其基本原理是根據(jù)DNA序列的互補性，用已知的熒光素、生物素標(biāo)記的核酸探針與待檢測樣本的DNA進行雜交，形成可檢測的雙鏈核酸雜交。

2.熒光原位雜交探針標(biāo)記方法

熒光原位雜交探針的熒光標(biāo)記有兩種方法。間接標(biāo)記法是用生物素標(biāo)記DNA探針，直接標(biāo)記法是將熒光素與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架直接結(jié)合。直接標(biāo)記法檢測步驟簡單，但靈敏度不如間接標(biāo)記法，因為信號不能放大。

3.熒光原位雜交探針類型

（1）雙鏈DNA探針， 目前應(yīng)用廣泛，簡便易行，不易降解，一旦克隆成功，就可運用相同的擴增和標(biāo)記程序獲得大量的標(biāo)記探針

（2）單鏈DNA（ssDNA）探針，穩(wěn)定，更易于使用，更具特異性對RNase具有抗性，更好的組織滲透性，無自我雜交

（3）RNA探針（核糖體探針），更高的熱穩(wěn)定性，更好的組織穿透力，特異性更高，RNase的影響更小

（4）合成寡核苷酸，經(jīng)濟、穩(wěn)定、特異性強，對RNase具有抗性，組織滲透性好，重現(xiàn)性好

4.熒光原位雜交技術(shù)優(yōu)勢

熒光原位雜交法具有其他雜交方法沒有的優(yōu)勢：

（1）FISH是非放射性元素標(biāo)記，更加安全；

（2）FISH的實驗周期短，可同時檢測多種序列；

（3）FISH技術(shù)因其多次免疫化學(xué)反應(yīng)增強了雜交信號，靈敏度與放射性探針相當(dāng) 。

5.熒光原位雜交應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因表達分析、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常檢測、癌癥的快速臨床診斷、人類產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域，有著非常重要的應(yīng)用價值。

6.卡梅德生物能夠為客戶提供高質(zhì)量的熒光原位雜交服務(wù)

卡梅德生物（KMD Bioscience）致力于細(xì)胞生物學(xué)研究多年，擁有經(jīng)驗豐富的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)服務(wù)人才，搭建了完備的FISH技術(shù)服務(wù)平臺，我們能夠提供包括從探針設(shè)計、樣本處理、雜交檢測、基因表達研究到數(shù)據(jù)分析等一站式FISH技術(shù)服務(wù)，擁有規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)的檢測程序，從而保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低了假陽性和假陰性。卡梅德生物同時可定制合成多種類探針，包括大部分植物、動物、微生物，定制的探針大于150kb，特異性強，出錯率低；利用熒光原位雜交技術(shù)，卡梅德生物還可以提供單克隆源性鑒定服務(wù)。

7.熒光原位雜服務(wù)交流程介紹

卡梅德生物可以提供熒光原位雜交服務(wù)，主要技術(shù)流程如下：探針設(shè)計與合成，樣本處理，原位雜交實驗，成像拍照，結(jié)果分析與項目報告。

7.1探針設(shè)計和合成

7.1.1即用型探針可以直接雜交，非即用型探針需要與與雜交液按 1：1：1：50 比例稀釋，85℃變性 3 分鐘，37℃平衡 5 分鐘。

7.2樣本處理

7.2.1脫蠟復(fù)水，將石蠟切片浸入二甲苯中脫蠟，2 次，每次 10 分鐘；

7.2.2片子依次過乙醇、85%、75%乙醇，各 3 分鐘，PBS 3 分鐘；

7.2.3 片子加胃蛋白酶消化液，37℃消化 15-30 分鐘，PBS 洗滌 2 次，每次 3 分鐘；

7.2.4預(yù)雜交：提前 30 分鐘從冰箱中取出雜交液恢復(fù)至室溫，滴加雜交液，雜交 儀中 55℃孵育 1 小時。

7.3原位雜交實驗

7.3.1取出預(yù)雜交好的片子，去除多余液體，將探針滴加于片子上，覆蓋組織， 放于雜交儀中 37℃雜交過夜；  

7.3.2片子入 2×SSC（0.1％NP-40）中洗滌 3 次，每次 5 min；

7.3.3 滴加 20ul DAPI-Antifade Solution 蓋玻片封片，避光孵育 20min。

7.4成像拍照

卡梅德生物不同樣本熒光原位雜交實驗結(jié)果拍照：

7.5結(jié)果分析與項目報告

卡梅德生物交付：剩余的探針、切片以及樣品，原始雜交顯色成像照片，詳細(xì)的實驗報告（包含完整的實驗流程及結(jié)果分析）。

卡梅德生物的技術(shù)專家將提供專業(yè)的一對一的定制化方案以及不同種屬樣本的檢測，從探針設(shè)計、染色體/細(xì)胞/細(xì)菌制備/培養(yǎng)到結(jié)果呈現(xiàn)的全套定制熒光原位雜交（FISH）服務(wù)，交付完整的實驗報告和拍照圖片。