線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)的應用及使用方法！

       線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)的應用及使用方法！

一、背景

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)是利用JC-1探針檢測線粒體膜電位變化的試劑盒，可以快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化，可以用于早期的細胞凋亡檢測。

本試劑盒染料JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential）△Ψm的理想熒光探針。與其他的陽離子染料如DiOC6(3)和羅丹明123相比，特異性更高，對線粒體膜電位變化的特異性高于質(zhì)膜電位變化，對線粒體去極化檢測的檢測一致性更好；紅綠色熒光強度比率只受線粒體膜電位的變化，不受線粒體大小，形狀，密度的差異干擾；檢測靈敏度強，對細胞應激反應的微小異質(zhì)性都能辨別。

JC-1有單體和聚合體兩種形式，兩者的發(fā)射光譜不同。JC-1單體(J-monomer)的激發(fā)波長為514nm，發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的激發(fā)波長為585nm，發(fā)射波長為590nm。

JC-1可以透過細胞質(zhì)膜進入細胞，以單體狀態(tài)游離于胞質(zhì)內(nèi)，正常健康細胞的線粒體的膜電位較高，具有極性，JC-1依賴于膜電位的極性被迅速攝入線粒體的基質(zhì)內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體488nm激發(fā)時的發(fā)射波長為590nm，發(fā)射光為橙紅色熒光，在流式圖上表現(xiàn)為FL1和FL2雙陽性；當細胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，線粒體膜電位較低，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，從線粒體內(nèi)釋放到細胞質(zhì)，此時JC-1為單體，488nm激發(fā)時發(fā)射波長為527nm，可以產(chǎn)生綠色熒光，形成流式圖中細胞FL1為陽性。凋亡細胞則大多為FL1單陽性。

這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。

二、使用方法

1、收集樣本細胞以及陰性、陽性對照細胞。細胞數(shù)量在2-5X105個。

2、用PBS洗滌細胞兩次。離心收集細胞。

3、用500ul JC-1染色工作液將細胞重懸，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15-30分鐘。

4、在4°C，300-500×g力離心間5分鐘，棄培養(yǎng)基，收集細胞。

5、用冷PBS洗滌細胞兩次。

6、用500ul PBS將細胞重懸。

7、用流式細胞儀或熒光分光光度計檢測分析結(jié)果，或者用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

三、應用

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)可以用于精子線粒體膜電位檢測在評估男性生育力中的作用研究：

探索育齡男性精子線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)與精液質(zhì)量、血清性激素、促性腺激素的關(guān)系及其在評估男性生育力中的作用。

方法：募集2017年6月-2020年11月至就診的男性志愿者及其配偶共90例,收集基本資料,進行精液常規(guī)分析,檢測精子MMP、精子頂體反應率(acrosomal reaction,AR)、血清性激素(T、E2)、促性腺激素(LH、FSH、PRL)、生育力指數(shù)(fertility index,FI)。分析募集者精子MMP與上述其他各指標之間的關(guān)系;計算本組募集者精子MMP截斷值并根據(jù)截斷值分為高精子MMP組和低精子MMP組,同時分析比較兩組在本研究觀察期內(nèi)募集者配偶的懷孕率;根據(jù)精子濃度、精子前向運動率(progressive motility,PR)及正常形態(tài)率是否低于參考下限值,將男性志愿者分為正常組和異常組,分析上述各指標的組間差異。

結(jié)果：(1)異常組與正常組一般特征及精液參數(shù)對比:一般特征具有可比性,兩組男性志愿者配偶隨訪期內(nèi)懷孕人數(shù)和兩組既往配偶有生育史人數(shù)無顯著性差異(p>0.05);精液量、p H、畸形精子指數(shù)(the teratozoospermia index,TZI)、精子尾部缺陷率、血清性激素及促性腺激素、精子AR無顯著性差異(p>0.05)。異常組精子畸形指數(shù)(the sperm deformity index,SDI)、精子頭部及頸部缺陷率較正常組高(p<0.05),精子MMP和FI較正常組明顯降低(p<0.05)。

(2)精子MMP與各指標相關(guān)分析:精子MMP與FSH(r=-0.258,p<0.05)及精子頭部畸形率(r=-0.254,p<0.05)呈負相關(guān),與精子濃度(r=0.285,p<0.05)、精子正常形態(tài)率(r=0.319,p<0.05)、精子PR(r=0.504,p<0.05)、精子總活力(PR+NP(non-progressivity motility,NP))(r=0.463,p<0.05)、FI(r=0.443,p<0.05)呈正相關(guān)。與年齡、血清激素、LH、PRL、SDI、TZI及精子AR無統(tǒng)計學相關(guān)性(p>0.05)。

(3)精子MMP對精子質(zhì)量正常與否的ROC曲線分析:精子MMP曲線下面積(AUC)為0.814(p<0.05,95%CI:0.725-0.903),Cut-off值為0.507,敏感性0.73,特異性0.87。

(4)高精子MMP組和低精子MMP組募集者配偶懷孕率的對比:精子MMP>50.7%組男性志愿者配偶隨訪期內(nèi)懷孕人數(shù)明顯高于精子MMP≤50.7%組(χ2=5.035,p=0.025),兩組既往配偶有生育史人數(shù)無顯著性差異(p>0.05)。

結(jié)論：精子MMP是反應精子功能、精確評價精子質(zhì)量及男性生育力的潛在指標,提示臨床中在精子常規(guī)參數(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合精子MMP能更精確全面地評價育齡男性的生育力。

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