氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測(cè)試劑盒(DTNB比色法)說(shuō)明書(shū)

 氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測(cè)試劑盒(DTNB比色法)

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1827

產(chǎn)品規(guī)格：100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

谷胱甘肽(glutathione，GSH)存在于幾乎身體的每一個(gè)細(xì)胞，參與細(xì)胞許多功能活動(dòng)，是一種氧自由基消除劑。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化損傷，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)，故常簡(jiǎn)寫(xiě)為G-SH或GSH，易與某些藥物(如撲熱息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、鉛、汞、砷等)等結(jié)合，具有整合解毒作用，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用。谷胱甘肽是研究活性氧和自由基的重要指標(biāo)，亦是機(jī)體氧化物牽累的重要指標(biāo)。還原型谷胱甘肽 (GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，能可逆的轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰?/span>(GSSG)，其存在形式會(huì)隨著細(xì)胞內(nèi)代謝的情況而發(fā)生相互轉(zhuǎn)變。

氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測(cè)試劑盒(DTNB比色法)(GSSG Assay Kit)是一種簡(jiǎn)單易行的GSSG檢測(cè)的試劑盒，其檢測(cè)原理是谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH，由GSSG還原成的GSH和樣品本身含有的GSH都與發(fā)色底物DTNB反應(yīng)，生成黃色的TNB和GSSG，總谷胱甘肽(T-GSH，GSSG+GSH)就相當(dāng)于一個(gè)呈色的限速反應(yīng)，T-GSH含量決定了黃色含量，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ惹宄龢悠分械?/span>GSH，然后利用GR將GSSG還原成GSH，通過(guò)分光光度法檢測(cè)412nm處吸光度，帶入回歸方程就可以計(jì)算出GSSG的量。該試劑盒可用于測(cè)定血漿、血清、植物或動(dòng)物組織、細(xì)胞等樣品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，亦可檢測(cè)總谷胱甘肽(T-GSH)含量。該試劑盒僅用于科研，不用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 離心管或小試管

2. 蒸餾水

3. PBS或生理鹽水

4. 勻漿器或研缽

5. 低溫離心機(jī)

6. 水浴鍋

7. 比色杯

8. 分光光度計(jì)

操作步驟(僅供參考):

1. 配制GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液：取10mg還原型谷胱甘肽(GSH)標(biāo)準(zhǔn)加入3.25ml ddH2O，溶解并混勻，即為還原型GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(10mM)；一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20℃保存。

2. 配制DTNB儲(chǔ)存液：該本試劑盒提供的80mg DTNB中加入2ml DMSO，溶解并混勻，即為DTNB儲(chǔ)存液(40mg/ml)；一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20℃保存。

3. 配制50×GSH還原酶：按GSH還原酶原液:GSH Assay Buffer=1:49的比例混合，即為50×GSH還原酶；-20℃保存，3個(gè)月有效。

4. 配制GSH 檢測(cè)工作液：按下表配制GSH檢測(cè)工作液。

5. 配制T-GSH檢測(cè)工作液：按下表配制T-GSH檢測(cè)工作液。

6. 配制蛋白沉淀工作液：在本試劑盒提供的2.5g蛋白沉淀劑中加入50ml ddH2O，配制成50ml 5%的水溶液，即為蛋白沉淀工作液，4℃保存。

7. 配制標(biāo)準(zhǔn)品：把還原型GSH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液(10mM)用蛋白沉淀工作液稀釋成50μM標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后依次稀釋成25、15、10、5、2μM GSH溶液，取50、25、15、10、5、2 μM GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液6個(gè)點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：由于GSH標(biāo)準(zhǔn)在蛋白沉淀工作液中不太穩(wěn)定，用蛋白沉淀工作液配制的GSH溶液必須新鮮配制后使用，不可凍存后再使用。

8. 配制NADPH工作液：在本試劑盒提供的10mg NADPH中加入1ml ddH2O，溶解并混勻，即為NADPH儲(chǔ)存液(10mg/ml)。一部分立即使用，其余適當(dāng)分裝后-20℃保存。按0.1ml NADPH儲(chǔ)存液(10mg/ml)加入8.23ml的比例加入GSH assay buffer，充分混勻，即為NADPH工作液(0.12mg/ml)。

9. 準(zhǔn)備樣品：

①紅細(xì)胞或血漿樣品：取新鮮血液，600g離心10min，沉淀為紅細(xì)胞，上清為血漿。對(duì)于紅細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，取約100μl紅細(xì)胞沉淀或血漿，加入100μl蛋白沉淀工作液，充分Vortex振勻。4℃或冰浴放置10min，4℃ 10000g離心10min，取上清，用于GSSG測(cè)定，樣品需暫時(shí)4℃保存?zhèn)溆茫涣⒓礈y(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)10天。對(duì)于處理好的紅細(xì)胞樣品最后需用蛋白沉淀工作液稀釋10倍后再進(jìn)行后續(xù)的測(cè)定，而對(duì)于血漿樣品，應(yīng)直接取80μl進(jìn)行測(cè)定。

②植物或動(dòng)物組織樣品：取組織用液氮速凍迅速研磨，按每40mg加入100μl蛋白沉淀工作液 (亦可不用液氮，而是直接加入蛋白沉淀工作液至組織后勻漿或研磨)，充分Vortex振勻，再加入300μl蛋白沉淀工作液，用勻漿器充分勻漿。4℃孵育10min，4℃ 10000g離心10min，取上清，用于GSSG測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存?zhèn)溆茫涣⒓礈y(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)10天，對(duì)于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，稀釋倍數(shù)通常為5～20倍。

③細(xì)胞樣品：PBS洗滌細(xì)胞1次，離心收集細(xì)胞，吸盡上清，加入細(xì)胞沉淀3倍體積的蛋白沉淀工作液，充分Vortex振勻(收集細(xì)胞前后分別對(duì)離心管進(jìn)行稱(chēng)重，從而就可以計(jì)算出細(xì)胞沉淀的重量，10mg細(xì)胞沉淀的體積可以粗略地看做10ml。)對(duì)樣品進(jìn)行快速的凍融后，4℃或冰上孵育5min，4℃ 10000g離心10min，取上清，用于GSSG測(cè)定。樣品需暫時(shí)4℃保存?zhèn)溆?，不立即測(cè)定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過(guò)10天，對(duì)于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，稀釋倍數(shù)通常為5～20倍。

10. GSH加樣：按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的GSH濃度過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

11. T-GSH加樣：按照下表設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的T-GSH濃度過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

12. GSH和T-GSH測(cè)定：立即用分光光度計(jì)或自動(dòng)生化分析儀測(cè)定410nm處吸光度，每隔2min測(cè)定1次，空白管調(diào)零，共檢測(cè)6min(亦可加入NADPH工作液反應(yīng)6min后檢測(cè)，只檢測(cè)1次)，以檢測(cè)其反應(yīng)速率ΔA/min。如果分光光度計(jì)不能測(cè)定410nm，可測(cè)定405～420nm處吸光度。

計(jì)算： 

①動(dòng)力學(xué)測(cè)定法：根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定得到的吸光度計(jì)算出ΔA₄₁₀/min，以GSH標(biāo)準(zhǔn)的濃度(50、25、15、10、5、2μM)為橫坐標(biāo)，以ΔA₄₁₀/min為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。根據(jù)待測(cè)的ΔA₄₁₀/min，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程可以計(jì)算出測(cè)定時(shí)測(cè)定時(shí)樣品還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

GSSG含量=總谷胱甘肽(T-GSH)的含量-還原型谷胱甘肽(GSH)含量

動(dòng)力學(xué)法測(cè)定結(jié)果比終點(diǎn)測(cè)定法的結(jié)果精確，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最初樣品的使用量，可以計(jì)算出每毫克組織或細(xì)胞中的谷胱甘肽的含量，通過(guò)測(cè)定蛋白濃度，從而計(jì)算出樣品的蛋白量，最后計(jì)算出每mg蛋白中還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

②終點(diǎn)測(cè)定法：即反應(yīng)6min僅測(cè)定1次吸光度的方法。以GSH標(biāo)準(zhǔn)的濃度(50、25、15、10、5、2μM)為橫坐標(biāo)，以ΔA₄₁₀/min為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程可以計(jì)算出測(cè)定時(shí)樣品中還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。終點(diǎn)測(cè)定法比動(dòng)力學(xué)法快捷，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最初樣品的使用量，可以計(jì)算出每毫克組織或細(xì)胞中的谷胱甘肽的含量，通過(guò)測(cè)定蛋白濃度，從而計(jì)算出樣品的蛋白量，最后計(jì)算出每mg蛋白中還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

GSSG含量=總谷胱甘肽(T-GSH)的含量-還原型谷胱甘肽(GSH)含量

參考區(qū)間：

          成年全血GSH    1.02±0.17mmol/L

注意事項(xiàng)：

1. GSH比較穩(wěn)定，血液樣品以ACD抗凝后冰箱4℃保存，3～4周內(nèi)穩(wěn)定。

2. 請(qǐng)盡量使用新鮮的細(xì)胞或血液進(jìn)行測(cè)定，而不要使用凍存的細(xì)胞或血液進(jìn)行測(cè)定，避免使GSH活性下降。

3. 全血GSH與吸煙和鍛煉成正比。

4. 測(cè)定各管時(shí)，各孔溫度均需達(dá)到室溫或25℃，否則影響結(jié)果。

5. 輕度溶血樣本對(duì)GSH測(cè)定無(wú)影響。

6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期：6個(gè)月有效。