透射電鏡樣品制備技術(shù)之生物樣品制備流程

透射電鏡常用的50-100 kV電子束來說，樣品的厚度控制在10～100 nm為宜。由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，需要把標(biāo)本切成厚度小于0.1 µm以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm，也可進(jìn)行冷凍超薄切片。

超薄切片技術(shù)是為透射電子顯微鏡觀察提供薄樣品的專門技術(shù)，研究材料類、生物類樣品的基本技術(shù)，尤其是觀察細(xì)胞、組織、器官等的超微結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)常用的技術(shù)。也是電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡等技術(shù)的關(guān)鍵性技術(shù)。它在生物學(xué)的發(fā)展過程中占據(jù)重要的地位，目前各種細(xì)胞、組織的超微結(jié)構(gòu)知識(shí)幾乎都是由它提供的。

冷凍超薄切片機(jī) Leica EM UC7

取材→固定→脫水→包埋（滲透、包埋、聚合）→超薄切片→電子染色（生物類）

取材→清洗→包埋（滲透、包埋、聚合）→超薄切片→電子染色（材料類）

生物樣品超薄切片要求：

（2）切片厚度50-100 nm為宜：太薄反差低；太厚反差好，但結(jié)構(gòu)重疊，電子束不能穿透；

（3）切片應(yīng)耐電子束的強(qiáng)烈照射，不變形不升華；

（4）切片能夠適當(dāng)被染色，保證一定的反差；

（5）切片均勻，無皺褶、刀痕，無染色劑或其他化學(xué)物質(zhì)的沉淀。

目地和要求

（1）新鮮。(材料離體后1-5 min內(nèi)進(jìn)入固定液，避免細(xì)胞自溶和結(jié)構(gòu)變化)

（2）體積小。(厚度<1 mm，長度寬度均<5 mm，固定液滲透能力有限，組織太大會(huì)導(dǎo)致無法固定充分）

（3）機(jī)械損傷小。(動(dòng)作輕巧，器械鋒利，避免對組織的擠壓和推拉，建議用剃須刀片、手術(shù)刀片、手術(shù)剪刀。)

（4）低溫操作，器械、容器、固定液均需預(yù)冷（降低酶的活性，減少組織自溶）。

（5）取材部位準(zhǔn)確，且注意材料的方向性和定位。

目的和要求：終止組織細(xì)胞的生化過程同時(shí)把它們的超微結(jié)構(gòu)改變控制在最小范圍內(nèi)，并保護(hù)這些結(jié)構(gòu)在后續(xù)的脫水、包埋等過程中不被破壞；將蛋白、離子等內(nèi)容物保留在原位，以便后續(xù)的研究。

（1）破壞細(xì)胞的酶活性系統(tǒng)

（2）穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分，并保存之

（3）接近細(xì)胞生活狀態(tài)的滲透壓,使細(xì)胞不收縮或膨脹

（4）在組分的分子之間建立交聯(lián)，提供骨架穩(wěn)定細(xì)胞器的空間構(gòu)型

（5）提供一定的電子反差

戊二醛（C5H8O2)：滲透性好，保存蛋白質(zhì)、酶活性，穩(wěn)定糖元，無電子染色作用，固定脂類和膜差。可長時(shí)固定（低溫可達(dá)半年）。

鋨酸（OsO4)：強(qiáng)氧化劑，固定脂類、膜結(jié)構(gòu)，有電子染色作用；破壞酶活性。

多聚甲醛：優(yōu)良地保存酶活性，用于細(xì)胞化學(xué)。

緩沖液：仿效細(xì)胞外液成分，對細(xì)胞富有生理保護(hù)。維持穩(wěn)定的pH值；提供適當(dāng)?shù)臐B透壓；提供適當(dāng)?shù)碾x子成分使樣品不抽提，不沉淀。

    1.pH值：動(dòng)物組織7.2-7.4，植物6.8-7.0，高度含水組織8.0-8.4

    2.緩沖液類型：磷酸緩沖液、緩沖液等，0.05-0.1 mol/L

    3.滲透壓：KCl, NaCl, 蔗糖調(diào)節(jié)

    4.固定劑濃度：戊二醛2-6%等

    5.材料大?。?.5-1 mm3

操作步驟：

戊二醛固定液：有細(xì)胞壁的樣品5%，無細(xì)胞壁樣品3%。加入緩沖體系，確保生物樣本內(nèi)外滲透壓，避免細(xì)胞縮小或吸漲。

30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步驟每次15-20 min)→100％(2-3次，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 

常用Epon 812、Spurr、LR white等

可手工、機(jī)械修塊。

醋酸鈾：主要染核酸、核蛋白、細(xì)胞核、結(jié)締組織。要避光，有微弱的放射性

檸檬酸鉛：主要染膜結(jié)構(gòu)、脂類、核酸。易與CO2反應(yīng)成沉淀，染色中應(yīng)避免。

步驟：單染：鉛鹽單染,鈾鹽單染。