PCR體系及各類常見PCR辨析

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction)簡稱PCR，是一種體外高效擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)的發(fā)明人是Kary Mullis，他從1983年開始研究PCR技術(shù)，1985年開始被逐漸采用，成為分子生物學(xué)的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛的應(yīng)用，在臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)研究和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有重要意義。PCR是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，它用加熱的辦法讓需要擴(kuò)增的DNA片段變性解鏈成兩條單鏈，人工合成的一對引物讓它們結(jié)合到DNA模板（分別結(jié)合到兩條鏈上）的兩端，DNA聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。了解了PCR的基本過程，再一起來學(xué)習(xí)一下PCR體系及各類常見PCR辨析吧！

PCR體系

1. 模板

需要研究或擴(kuò)增的目的核酸分子，DNA可以直接擴(kuò)增，RNA需要增加一步逆轉(zhuǎn)錄，或者在體系中加逆轉(zhuǎn)錄酶一步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

2. 引物

良好設(shè)計的引物，是擴(kuò)增特異性及擴(kuò)增效率的關(guān)鍵因素之一；

3. Taqase

PCR體系的核心組分，Taqase的性能，直接決定了擴(kuò)增體系能否達(dá)到實驗要求；

針對不同類型的模板、特異性的要求、產(chǎn)物保真度的要求、擴(kuò)增產(chǎn)物的長度，需要選用能滿足對應(yīng)要求的Taqase；所選用的酶如果不匹配，實驗是無法成功的；

對一株Taqase的性能評價，主要是如下幾個方面：擴(kuò)增效率，擴(kuò)增速度，保真度，除了催化鏈延伸之外的其它活性，抗逆性等；

4. dNTP

dNTP的濃度和質(zhì)量，也是影響擴(kuò)增產(chǎn)率的一個重要因素；dNTP分子中，含有一個高能磷酸鍵，是影響dNTP穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，高能磷酸鍵的斷裂也是造成dNTP質(zhì)量不合格的分子層面的原因；

5. Buffer

為PCR反應(yīng)體系提供穩(wěn)定的工作環(huán)境，主要環(huán)境因素為pH值，離子強(qiáng)度等；

6. Mg++

因為鎂離子對Taqase活性影響大，所以一般buffer之外，還單獨帶一管Mg++，方便用戶靈活調(diào)節(jié)體系里面Mg++濃度；

除了上述六種必要的組分之外，還有較多的工具蛋白或者小分子化合物，能對PCR體系起到相應(yīng)的作用，這方面累積的研究成果也比較多。

各類常見PCR辨析

1. PCR，通常指的是普通PCR，以雙鏈DNA為模板，以dNTP為底物，大量（30個循環(huán)理論上可以使產(chǎn)物增加到模板初始摩爾數(shù)的10的9次方倍）擴(kuò)增雙鏈DNA。產(chǎn)物通常以電泳及凝膠成像方式來分析。

2. qPCR和Real-time PCR，指的是實時熒光定量PCR，以DNA或cDNA為模板，以dNTP為底物，以熒光基團(tuán)為報告分子，收集熒光信號從而對擴(kuò)增出的DNA進(jìn)行定量分析。為避免和RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）混淆，現(xiàn)在一般不太常用real-time PCR，通常交流，用qPCR指代更明確。

3. RT-PCR，指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR，以由mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以dNTP為底物，進(jìn)行DNA的擴(kuò)增及檢測。

4. RT-qPCR，指的是實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，是qPCR+RT-PCR的組合，將總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再作為模板，以dNTP為底物，進(jìn)行產(chǎn)物的定量分析。