免疫共沉淀Co-IP實驗步驟

Co-IP（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復合體的一項技術，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。

免疫共沉淀Co-IP實驗步驟

細胞轉(zhuǎn)染

1.鋪細胞，轉(zhuǎn)染細胞。本次轉(zhuǎn)染的兩個蛋白分別帶有FLAG和HA標簽。

裂解細胞

2.去除培養(yǎng)基，PBS吹下細胞，離心去上清。將細胞沉淀轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，PBS洗，離心去上清，加1ml裂解液。

3.冰上孵育40min，每10min震蕩一次。

4.超聲破碎細胞結(jié)構和打斷染色質(zhì)。冰上操作。

這個功率和時間要你自己摸索，不同細胞不同機器都會有差別，一般的國產(chǎn)機器對10^7細胞用20%功率超聲4分鐘左右即可比較充分（超聲2秒，停2秒）。直到溶液相對比較清澈，沒有絲狀DNA。

5. 4度，12000 rpm/min離心10mins。

6.轉(zhuǎn)移上清(上清體積會有所增加，可能是因為細胞溶解了)到新的預冷的試管中。取50ul上清作為input。

7.將剩余樣品分為兩份,其中一份加入FLAG(MOUSE)抗體1uL（轉(zhuǎn)染的蛋白帶有FLAG標簽），一份加入相應宿主的普通IgG(mouse),4℃輕搖過夜，使抗體和目標蛋白充分結(jié)合。

抗體與beads的結(jié)合

8.將beads吸出至新管（每個107樣品準備40ul beads懸液，約含20ul Protein A/G beads，細胞較少時可適當減少，最少10ul懸液否則后續(xù)操作會很困難）用2倍體積(PBS+0.1%triton-100)洗滌3次，去上清。3000rpm離心1min基本可以充分沉淀，轉(zhuǎn)速時間可調(diào)。

9.用等體積的buffer重懸beads。

10.在每個樣品中加入20ul beads懸液，4℃輕搖2小時，使抗體和beads充分結(jié)合。

樣品的收集和洗滌

11.將IP過后的樣品離心 3000rpm 1min。

12.將上清轉(zhuǎn)移至新管 標記為Flow through。

13.加入500ul (PBS+0.1%triton-100)洗滌beads 4℃輕搖5min  3000rpm 1min 棄上清。

14.洗滌三次，最后一次盡量去除上清。

樣品的洗脫

15.用30-100ul裂解液重懸beads，具體體積根據(jù)SDS-PAGE需求自定。

16.將樣品和input中加入合適體積的loading buffer混勻，必要時可以將Flow through進行制樣檢測。

17.95℃-100℃熱變性10-15min，冷卻后凍存?zhèn)溆谩?/span>

18.SDS-PAGE和WB檢測。IP用的是FLAG抗體，檢測HA。

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