動(dòng)脈粥樣硬化中血流紊亂會(huì)損害MerTK介導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的胞葬作用

Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis

Keywords: Disturbed flow; MerTK; RNA-seq; atherosclerosis; efferocytosis; proteomics.

動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性心臟病和中風(fēng)最常見的潛在原因。大量證據(jù)表明，動(dòng)脈分支和彎曲處的擾動(dòng)流（d-flow）模式更易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變，而存在高剪切應(yīng)力的穩(wěn)定層流（s-flow）區(qū)域則可防止動(dòng)脈粥樣硬化。主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）是血管壁內(nèi)層的主要成分，直接暴露在血流中，在各種化學(xué)和機(jī)械刺激下對血管功能發(fā)揮重要作用。

MER 原癌基因酪氨酸激酶（MerTK）是 TAM（Tyro3、Axl 和 MerTK）受體家族的成員，在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，其在有效清除凋亡細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，這一過程稱為胞葬作用（Efferocytosis）。晚期動(dòng)脈粥樣硬化中胞葬作用受損可導(dǎo)致繼發(fā)性細(xì)胞壞死和壞死碎片積聚形成的壞死核心，從而引發(fā)斑塊破裂和急性血栓性心血管事件。最近研究報(bào)道了原發(fā)性主動(dòng)脈 ECs 具有很高的胞葬作用能力，且在血管衰老中起重要作用。

然而，以往的研究并未顯示血流模式與 EC 胞葬作用之間的直接聯(lián)系，以及血流模式與 MerTK 表達(dá)之間的相互作用。MerTK 在 d-flow 介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中的作用及其對動(dòng)脈粥樣硬化病理過程的影響也是未知的。因此，美國佐治亞州立大學(xué)生物學(xué)系的課題組在最近的研究中旨在解決這些未知問題，并證明了血流模式在調(diào)節(jié)MerTK 介導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞葬作用中發(fā)揮重要作用。研究成果發(fā)表在 Theranostics 期刊題為“Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis”。

MerTK 主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，關(guān)于MerTK 在 ECs 中表達(dá)的研究非常有限。因此，實(shí)驗(yàn)首先對健康個(gè)體及惡性白血病患者的不同類型造血細(xì)胞的表觀遺傳圖譜進(jìn)行了大數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)MerTK 在 CD14++CD16- 單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和效應(yīng)B 細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞和靜脈 ECs 中高度表達(dá)（圖1 A）。進(jìn)一步大數(shù)據(jù)分析（圖1 B）顯示，MerTK 在血管（如主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈和脛動(dòng)脈）、心臟（如左心耳和左心室）和血液（如轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞和全血）中表達(dá)。

然后研究了凋亡細(xì)胞是否可以激活主動(dòng)脈 ECs 中的 MerTK 表達(dá)和胞葬作用。Western blotting 顯示，凋亡的 Jurkat 細(xì)胞在原代人主動(dòng)脈 ECs（HAECs）中顯著誘導(dǎo) MerTK 表達(dá)（圖1 C）。免疫染色顯示，HAECs 具有很高的胞葬作用能力，可以清除凋亡的 Jurkat 細(xì)胞（圖1 D）。有趣的是，凋亡的 Jurkat 細(xì)胞以時(shí)間和劑量依賴性方式誘導(dǎo) MerTK 表達(dá)（圖1 E、F），且MerTK 表達(dá)在細(xì)胞比例為 1：1 時(shí)表達(dá)最高。

為了闡明被吞噬的 Jurkat 細(xì)胞是否是 HAECs 中 MerTK 表達(dá)增加的原因，將非凋亡的 Jurkat 細(xì)胞和凋亡的 Jurkat 細(xì)胞與 HAEC 一起孵育（圖1 G）。一方面，發(fā)現(xiàn) MerTK 在 Jurkat 細(xì)胞中高表達(dá)；另一方面，發(fā)現(xiàn)凋亡的 Jurkat 細(xì)胞顯著激活 HAECs 中的 MerTK 表達(dá)。這表明凋亡的 Jurkat 細(xì)胞可部分解釋 EC MerTK 表達(dá)的增加。

為了研究 d-flow 在 HAECs 中 MerTK 表達(dá)中的作用，應(yīng)用了低振蕩剪切應(yīng)力（OSS，± 5 dynes/cm2，1Hz，1 h）和d-flow（12 ± 4 dynes/cm2，1 h）。與靜態(tài)組相比，OSS 顯著抑制 HAECs 中的胞葬作用（圖1 H）。p70 S6 激酶（p70S6K）的激活是病理生理?xiàng)l件下血管重塑的重要過程；真核起始因子2α（EIF2α） 參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡激活；真核起始因子3a（EIF3A）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，其水平在晚期動(dòng)脈粥樣硬化病變中升高。研究表明，與靜態(tài)相比，OSS 顯著誘導(dǎo) p70S6K、EIF2α 和 EIF3A 的表達(dá)（圖1 I-K）。此外，d-flow 顯著抑制 MerTK 表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，表明促炎信號表達(dá)增加，如 NLRP3 炎性小體、TNF-α 和 NF-κB（圖1 L）。一致地，OSS 顯著抑制 MerTK 表達(dá)并誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，表現(xiàn)為eNOS、Gas 6（MerTK 配體）和TGF-β表達(dá)的降低（圖1 M）。

圖1     ECs 中的胞葬作用和 d-flow 在 MerTK 調(diào)節(jié)中的作用。

為了進(jìn)一步研究 d-flow 在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能中的作用，將暴露于d-flow或靜態(tài)條件下的HAECs 進(jìn)行了RNA-seq，隨后與凋亡的Jurkat細(xì)胞孵育。結(jié)果表明，d-flow 上調(diào)促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞死亡通路和衰老通路，這些都會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。此外，在 d-flow和動(dòng)脈粥樣硬化之間發(fā)現(xiàn)了幾種新的激活途徑，例如OMA1、SR 1078和 EIF2AK3 。還有幾種新的抑制途徑，例如 PPP1R15B、CX3CR1和 CITED2 。細(xì)胞因子和趨化因子分析顯示，d-flow 顯著抑制 CCL2、PF4和 IL-10的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo) IL-1β、CD40LG和 IFN-γ的表達(dá)。Z-score分析表明，d-flow 顯著激活 NF-κB 復(fù)合物、TNF 和 TLR4 通路。內(nèi)皮功能分析發(fā)現(xiàn)，d-flow 促進(jìn)血管系統(tǒng)的發(fā)育、血管發(fā)生和血管生成，同時(shí)抑制心臟發(fā)育、EC 運(yùn)動(dòng)和 EC 遷移。

然后利用動(dòng)脈粥樣硬化模型（PCL）將 AAV8-PCSK9 與高脂肪飲食（HFD）相結(jié)合（圖2 A），研究 MerTK 是否受體內(nèi)血流模式的調(diào)節(jié)。Western blotting 數(shù)據(jù)顯示，與s-flow（12 ± 4 dynes/cm2，24 h）的對照 RCA 相比，MerTK 在充滿 d-flow 的 LCA 中受到顯著抑制，表明 MerTK 對體內(nèi)血流模式敏感（圖2 B）。同樣，MerTK 在胸主動(dòng)脈直段（s-flow）中的表達(dá)遠(yuǎn)高于主動(dòng)脈弓（d-flow，圖2 C）。值得注意的是，在主動(dòng)脈弓中，缺乏 MerTK 的內(nèi)皮區(qū)域似乎在動(dòng)脈介質(zhì)巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出 MerTK 表達(dá)增加，這表明與血管功能障礙相關(guān)的凋亡細(xì)胞增加。圖2 D 顯示了 WT 小鼠 LCA 中凋亡標(biāo)志物 caspase-3 的免疫染色和主動(dòng)脈夾層的形成，表明 PCL 可能是主動(dòng)脈瘤和夾層的潛在模型。此外，RCA 中沒有斑塊形成，而 WT 和 MerTK- /- 小鼠的 LCA 中發(fā)現(xiàn)明顯的斑塊形成，與 RCA 相比，裂解的 IL-1β和 caspase-3 在有斑塊區(qū)域的 LCA 中均顯著增加（圖2 E）。

為探討體內(nèi)是否存在內(nèi)皮胞葬作用，對主動(dòng)脈弓中 MerTK 和 Caspase-3 進(jìn)行雙重免疫染色，發(fā)現(xiàn) WT 小鼠中MerTK 主要在內(nèi)皮中表達(dá)，并檢測到內(nèi)皮胞葬作用（圖2 F）。還研究了 WT 和 MerTK-/- 小鼠主動(dòng)脈弓中內(nèi)皮功能障礙標(biāo)志物的表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示，與 WT 小鼠相比，MerTK-/- 顯著誘導(dǎo) NF-kB、TLR4、vWF、VACAM-1 和 p22phox 的表達(dá)（圖2 G-J）。這些發(fā)現(xiàn)表明MerTK 對體內(nèi) d-flow 敏感，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮胞葬作用和內(nèi)皮功能障礙，提示MerTK在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中的內(nèi)皮功能障礙中起關(guān)鍵作用。

圖2    WT 和 MerTK- /- 小鼠的 PCL 手術(shù)和動(dòng)脈粥樣硬化模型。

最后，研究分析了 PCL 手術(shù)后 MerTK-/- 小鼠 RCA 和 LCA 的蛋白質(zhì)組學(xué)，其中包括 172 種上調(diào)蛋白和 87 種下調(diào)蛋白，前幾種蛋白變化包括 CD34、Col4a1和 Eln等。此外，發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）可能在 PCL 誘導(dǎo)的 d-flow 與血管功能之間的相互作用中發(fā)揮重要影響，MAPKs（如MAPK1、3 和 JNK）在接受急性 d-flow 的 LCA 中被激活。有趣的是，實(shí)驗(yàn)注意到有許多膠原蛋白信號參與來自激活和抑制因果網(wǎng)絡(luò)中的 LCA蛋白質(zhì)變化。與 RCA 相比，LCA 中誘導(dǎo)的膠原蛋白（如Col14a1、Pcolce、Col12a1、Col1a2/1、Plod2）顯著更高。LCA 與 RCA 的重疊網(wǎng)絡(luò)分析顯示了激活的通路（如膠原蛋白、AKT 和 CD34）和抑制通路（如MYC-、免疫球蛋白和其他膠原蛋白亞基）。

此外，還比較了 PCL 手術(shù)后 WT 和 MerTK-/- 小鼠 LCA 中蛋白質(zhì)組學(xué)的變化，發(fā)現(xiàn)了 52 種上調(diào)蛋白和 57 種下調(diào)蛋白。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與 WT LCA 相比，MerTK -/- LCA 中多種通路時(shí)被抑制時(shí)，如免疫細(xì)胞增殖、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架信號和 EIF2 信號，ASXL1 被特異性激活。ASXL1 在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用在很大程度上仍然未知，EIF2 下調(diào)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，表明 ASXL1 和 EIF2 可能在血流動(dòng)力學(xué)介導(dǎo)的 EC 胞葬作用中發(fā)揮新作用，這需要進(jìn)一步驗(yàn)證?；?Log2 倍變化的排名靠前的激活信號和抑制信號包括 Podip3、Klk1b22、lghg等。

粘附分子、促炎因子或抗炎因子和趨化因子在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用。因此，繼續(xù)研究了蛋白質(zhì)組學(xué)中 MerTK 在調(diào)節(jié)炎癥因子和趨化因子中的作用。與上述發(fā)現(xiàn)一致，與 WT 組相比，MerTK-/- 激活炎癥因子 MAP4K4，同時(shí)抑制抗炎因子（如IL-4、TGF-β 1 和 IL-10RA）和抗炎趨化因子CXCL12。與 WT LCA 相比，MerTK-/- LCA 中線粒體功能障礙激活、EIF2 信號、Eif3 和 P70s6K 信號和蛋白質(zhì)泛素化通路抑制。進(jìn)一步分析了激活信號網(wǎng)絡(luò)（如JUN-jun 原癌基因、FOS-fos 原癌基因、AP-1 家族激活蛋白-1 和 HIF1α-缺氧誘導(dǎo)因子 1亞基α）和抑制信號網(wǎng)絡(luò)（如IL-4、IL4 受體-IL4R 和 STAT3,4 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3,4）。并基于p 值總結(jié)了相關(guān)的疾病通路，表明 MerTK-/- 可能導(dǎo)致感染、腦功能障礙、心功能障礙、外周動(dòng)脈疾病、硬化病變和動(dòng)脈閉塞。

圖3   圖形概要

數(shù)據(jù)表明，原發(fā)性人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）中MerTK 對血流模式敏感，并受到擾動(dòng)流和振蕩剪切應(yīng)力的抑制。與凋亡細(xì)胞一起孵育的 HAECs 中的 RNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，d-flow 促進(jìn)促炎途徑和衰老途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫染色體內(nèi)數(shù)據(jù)表明，與 WT 組相比，MerTK-/- 通過上調(diào)內(nèi)皮功能障礙標(biāo)志物（如IL-1β、NF-κB、TLR4、MAPK 信號、vWF、VCAM-1 和 p22phox）和線粒體功能障礙加重d-flow 區(qū)動(dòng)脈粥樣硬化。有趣的是，MerTK-/- 可誘導(dǎo)明顯的異常內(nèi)皮增厚，伴有內(nèi)皮胞葬作用減少，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

總之，該研究為 d-flow、MerTK 和內(nèi)皮胞葬作用之間的關(guān)系及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的影響提供了證據(jù)。值得注意的是，主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有很強(qiáng)的胞葬作用能力，在 HAECs中凋亡的Jurkat細(xì)胞可在1 小時(shí)內(nèi)被高度吞噬。此外，由于HAECs 的細(xì)胞體積較大，其胞葬作用可能比巨噬細(xì)胞更高，這為內(nèi)皮胞葬作用可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化的有前途的治療靶點(diǎn)提供了重要的轉(zhuǎn)化線索。

參考文獻(xiàn)：Wu J, Liu S, Banerjee O, Shi H, Xue B, Ding Z. Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis. Theranostics. 2024 Mar 31;14(6):2427-2441. doi: 10.7150/thno.93036. PMID: 38646649; PMCID: PMC11024847.

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