人P2X7 真核表達(dá)載體構(gòu)建與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立

摘要：本研究旨在構(gòu)建人P2X7基因的真核表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定表達(dá)P2X7分子的HEK293細(xì)胞株。以人腦組織P2X7 cDNA為模板擴(kuò)增出P2X7基因，插入到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1/P2X7。通過G418輔助熒光篩選，成功建立了穩(wěn)定表達(dá)P2X7-EGFP的HEK293細(xì)胞系。該細(xì)胞系的建立為進(jìn)一步研究P2X7離子通道的結(jié)構(gòu)和功能奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

引言

P2X7受體是嘌呤能受體家族中的一種重要成員，屬于配體門控離子通道受體。P2X7受體被細(xì)胞外的ATP激活后，可以促進(jìn)Na+和Ca2+的流入以及K+的外排，同時激活下游通路信號的產(chǎn)生，包括NLRP3炎癥體的激活和促炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的釋放。這些效應(yīng)在心血管疾病、腫瘤學(xué)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種病理過程中發(fā)揮著重要作用。因此，對P2X7受體的深入研究具有重要意義。

構(gòu)建人P2X7基因的真核表達(dá)載體并建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，是研究P2X7受體結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。本研究通過構(gòu)建重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，成功建立了穩(wěn)定表達(dá)P2X7分子的細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究P2X7受體的生物學(xué)功能和潛在應(yīng)用提供了有力工具。

材料與方法

1. 材料

• 質(zhì)粒與菌株：人腦組織P2X7 cDNA模板、真核表達(dá)載體pEGFP-N1、大腸桿菌DH5α。

• 細(xì)胞系：HEK293細(xì)胞。

• 試劑：某試劑（用于DNA擴(kuò)增、質(zhì)粒提取、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等）、轉(zhuǎn)染試劑、G418抗生素、流式細(xì)胞儀抗體、Western blot抗體、激光共聚焦顯微鏡專用染料。

• 儀器：PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、Western blot系統(tǒng)、激光共聚焦顯微鏡。

2. 方法

2.1 P2X7基因的擴(kuò)增

以人腦組織P2X7 cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增P2X7基因。設(shè)計(jì)特異性引物，在PCR反應(yīng)體系中加入模板DNA、引物、dNTPs、緩沖液和DNA聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，純化回收目的片段。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將擴(kuò)增得到的P2X7基因片段插入到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1/P2X7。利用限制性內(nèi)切酶對載體和目的片段進(jìn)行雙酶切，將酶切后的目的片段與載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆并進(jìn)行測序驗(yàn)證。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒利用X-fect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，通過G418抗生素進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)P2X7-EGFP的HEK293細(xì)胞系。篩選過程中，利用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，并通過Western blot驗(yàn)證P2X7蛋白的表達(dá)。

2.4 細(xì)胞內(nèi)定位與表達(dá)水平檢測

利用激光共聚焦顯微鏡觀察P2X7-EGFP在HEK293細(xì)胞中的定位情況。同時，通過流式細(xì)胞儀和Western blot進(jìn)一步檢測P2X7蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果

1. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

通過PCR擴(kuò)增得到人P2X7基因片段，大小符合預(yù)期。將目的片段插入到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1/P2X7。經(jīng)測序驗(yàn)證，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，無突變。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

利用X-fect轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上。通過G418抗生素篩選，成功建立了穩(wěn)定表達(dá)P2X7-EGFP的HEK293細(xì)胞系。篩選過程中，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，P2X7-EGFP陽性細(xì)胞比例逐漸升高，最終穩(wěn)定在90%以上。

3. 細(xì)胞內(nèi)定位與表達(dá)水平檢測

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，P2X7-EGFP定位在HEK293細(xì)胞的細(xì)胞膜上，與預(yù)期相符。同時，流式細(xì)胞儀和Western blot檢測結(jié)果顯示，P2X7蛋白在HEK293細(xì)胞中高表達(dá)，表達(dá)水平穩(wěn)定。

討論

1. 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

本研究成功構(gòu)建了人P2X7基因的真核表達(dá)載體pEGFP-N1/P2X7，并通過測序驗(yàn)證其正確性。該重組質(zhì)粒的構(gòu)建為后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立奠定了基礎(chǔ)。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

X-fect轉(zhuǎn)染試劑具有高效、低毒的特點(diǎn)，適用于多種細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。本研究利用該試劑成功將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，并通過G418抗生素篩選建立了穩(wěn)定表達(dá)P2X7-EGFP的細(xì)胞系。篩選過程中，流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果為篩選效率提供了可靠依據(jù)。

3. 細(xì)胞內(nèi)定位與表達(dá)水平檢測

激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果證實(shí)了P2X7-EGFP在細(xì)胞膜上的定位，這與P2X7受體作為離子通道受體的特性相符。流式細(xì)胞儀和Western blot的檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了P2X7蛋白在HEK293細(xì)胞中的高表達(dá)，為后續(xù)功能研究提供了有力工具。

策略與創(chuàng)新

1. 實(shí)驗(yàn)策略

本研究采用PCR擴(kuò)增、質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選、細(xì)胞內(nèi)定位與表達(dá)水平檢測等一系列實(shí)驗(yàn)步驟，系統(tǒng)而全面地完成了人P2X7真核表達(dá)載體的構(gòu)建與穩(wěn)轉(zhuǎn)株的建立。實(shí)驗(yàn)過程中，通過嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

2. 研究創(chuàng)新

本研究成功建立了穩(wěn)定表達(dá)P2X7分子的HEK293細(xì)胞系，為后續(xù)研究P2X7受體的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力工具。同時，該細(xì)胞系的建立也為研究P2X7受體在心血管疾病、腫瘤學(xué)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等病理過程中的作用提供了重要平臺。

應(yīng)用前景

1. 基礎(chǔ)研究

穩(wěn)定表達(dá)P2X7分子的HEK293細(xì)胞系可用于研究P2X7受體的結(jié)構(gòu)和功能，包括離子通道特性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等。該細(xì)胞系還可用于篩選和鑒定P2X7受體的激動劑和拮抗劑，為藥物研發(fā)提供有力支持。

2. 臨床研究

P2X7受體在多種疾病中發(fā)揮著重要作用，包括心血管疾病、腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。穩(wěn)定表達(dá)P2X7分子的HEK293細(xì)胞系可用于研究這些疾病的發(fā)病機(jī)制，并為疾病治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

3. 生物技術(shù)應(yīng)用

穩(wěn)定表達(dá)P2X7分子的HEK293細(xì)胞系還可用于生物傳感器、細(xì)胞治療等生物技術(shù)領(lǐng)域。例如，利用該細(xì)胞系可構(gòu)建基于P2X7受體的生物傳感器，用于檢測細(xì)胞外ATP水平，為疾病診斷和治療提供新手段。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了人P2X7基因的真核表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)染建立了穩(wěn)定表達(dá)P2X7分子的HEK293細(xì)胞系。該細(xì)胞系的建立為后續(xù)研究P2X7受體的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力工具，也為藥物研發(fā)和疾病治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。同時，該細(xì)胞系在生物傳感器、細(xì)胞治療等生物技術(shù)領(lǐng)域也具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究為進(jìn)一步深入研究P2X7受體的生物學(xué)功能和潛在應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。