RetroBeads Gamma Lumafuor操作說明
1、包裝和稀釋:
將Lumafuor的珠粒包裝在密封的小瓶中，并將濃縮的珠粒懸浮在蒸餾水中。如果用紅色珠子作為神經(jīng)通路的反向示蹤，推薦采用稀釋法:在不降低珠子熒光標(biāo)記強(qiáng)度和質(zhì)量的情況下，可在大鼠視皮層使用1:4稀釋。但對(duì)于第一次實(shí)驗(yàn)，我們不建議使用稀釋的珠子，而是使用原液進(jìn)行注射示蹤。除了蒸餾水，常規(guī)的鹽溶液如氯化鈉和KCl也可以用作稀釋劑。如果使用綠珠，強(qiáng)烈建議使用未經(jīng)稀釋的原液。
2、存儲(chǔ):
為了避免蒸發(fā)，珠溶液應(yīng)存放在4度冰箱中。不要冷凍它！凍豆會(huì)沒用，不能用。干燥后的珠子也不能使用(不能重新懸浮)，產(chǎn)品沒有明顯的使用壽命。如果按要求儲(chǔ)存，可以儲(chǔ)存幾年。
3、注射:
珠子最好使用壓力注射，如1ml漢密爾頓微量注射器或氣動(dòng)注射系統(tǒng)。如需小面積微量注射(30-50nl)，可采用末端直徑30-50um的玻璃電極進(jìn)行注射，直徑較大的玻璃電極可用于常規(guī)反向示蹤(注射體積0.1-0.3ul)。然而，即使在較高的劑量下，珠子也不會(huì)從注射部位顯著擴(kuò)散(通常小于1 mm)。因此，為了盡可能完整地標(biāo)記投射到更大核的神經(jīng)元，需要多點(diǎn)注射。盡管磁珠帶負(fù)電荷，但不建議使用離子滲透法來示蹤磁珠。
4、存活時(shí)間:
在大多數(shù)恒溫脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中，檢測(cè)珠子的最短有效時(shí)間是24小時(shí)。在48小時(shí)內(nèi)，標(biāo)記強(qiáng)度隨注射時(shí)間增加，48小時(shí)后熒光強(qiáng)度保持不變。在冷血?jiǎng)游镏校瑱z測(cè)珠子的推薦時(shí)間是1周。目前還沒有檢測(cè)到珠子最長(zhǎng)的可檢測(cè)周期。然而，珠的熒光強(qiáng)度和質(zhì)量可以在體內(nèi)保持至少14個(gè)月不變，并且細(xì)胞可以被久標(biāo)記。在動(dòng)物或神經(jīng)元中沒有發(fā)現(xiàn)珠子的毒性作用。
5、固定和處理:
標(biāo)準(zhǔn)的固定方法是:0.1mpbs洗滌或灌注，固定在4%多聚甲醛中(0.1mpbs制劑，pH7.4)。用戊二醛固定會(huì)產(chǎn)生大量的組織自體熒光，會(huì)阻礙用珠子標(biāo)記的神經(jīng)元。而且在戊二醛固定組織中不會(huì)全觀察到綠珠，應(yīng)盡量避免。如果使用冰凍切片，切片應(yīng)該用PBS沖洗，并用明膠包被的載玻片干燥。風(fēng)干后，載玻片應(yīng)在二甲苯中保持透明1分鐘，然后用fluoromount或krystalon密封。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp .，F(xiàn)armingdale，NY獲得；Krystalon來自新澤西州吉布森鎮(zhèn)的Harleco (EM Industries)。
觀察:
紅珠里的染料是羅丹明，所以所有和羅丹明搭配的熒光濾鏡都可以。尼康公司的一些老款羅丹明濾鏡，由于背景較高，可能無法觀察到熒光珠。一般蔡司和萊茨的標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾鏡都能獲得較好的觀察效果。綠色熒光濾光片大部分都能很好的觀察到四季豆的熒光結(jié)果。設(shè)置為熒光黃的濾鏡可以獲得很強(qiáng)的明亮熒光，但也帶來了很高的背景干擾。結(jié)果表明，寬波段的熒光濾光片比窄帶濾光片能獲得更強(qiáng)的熒光信號(hào)。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的觀察和拍照，珠子的熒光沒有
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