分析實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)溶劑效應(yīng)的原理及其解決方法！

一、知識(shí)概述

在紫外-可見(jiàn)分光光度法、高效液相色譜法與氣相色譜法三個(gè)領(lǐng)域中均有“溶劑效應(yīng)”這一術(shù)語(yǔ)，分別具有不同的意義，由于篇幅有限，本文僅討論高效液相色譜法的反相色譜中的溶劑效應(yīng)，其他如正相色譜、離子色譜、親水作用色譜等可參考本文的分析方法與相關(guān)原理。

二、什么是溶劑效應(yīng)

目前較為的對(duì)于溶劑效應(yīng)的理解為稀釋劑溶劑強(qiáng)度大于流動(dòng)相時(shí)造成色譜峰變形的現(xiàn)象。如用純乙腈溶解樣品，注入流動(dòng)相為乙腈-水（18:82）的反相系統(tǒng)中，會(huì)造成峰分叉或拖尾的結(jié)果。但是這種概念不能解釋實(shí)踐中其他由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異?，F(xiàn)象，如溶出曲線研究中pH6.8溶出介質(zhì)的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況，這些情況中稀釋劑的溶劑強(qiáng)度并不一定大于流動(dòng)相，但是卻發(fā)生了色譜行為異常的現(xiàn)象。

鑒于許多由稀釋劑導(dǎo)致的色譜行為異?，F(xiàn)象不能用目前的溶劑效應(yīng)進(jìn)行解釋?zhuān)P者認(rèn)為有必要將溶劑效應(yīng)的概念進(jìn)行重新闡述：溶劑效應(yīng)，是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動(dòng)相中所處狀態(tài)的差異對(duì)色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴(yán)重，則可能造成明顯的色譜行為異常，如峰分叉、拖尾等。

三、常見(jiàn)溶劑效應(yīng)的表征

溶劑效應(yīng)是一種對(duì)色譜行為的不利影響，影響程度不同，色譜行為的表征也各有不同；較輕的影響可能沒(méi)有明顯的色譜行為的異常如無(wú)法觀察到的峰輕度展寬等，次一級(jí)的可能表現(xiàn)為峰明顯展寬、低柱效，較為嚴(yán)重表現(xiàn)有特定組分峰保留時(shí)間不穩(wěn)定、峰型異常、響應(yīng)值不穩(wěn)定等。

峰型異常是最直觀也是見(jiàn)的溶劑效應(yīng)的表現(xiàn)形式，如峰分叉、拖尾、前沿等。保留時(shí)間不穩(wěn)定與響應(yīng)值不穩(wěn)定也是較為常見(jiàn)的表現(xiàn)形式，可能也會(huì)伴隨峰型異常的情況；較為難以覺(jué)察到的溶劑效應(yīng)是峰型正常只是響應(yīng)值波動(dòng)較大的情況，易誤判為儀器故障等系統(tǒng)適用性方面的原因，如方法開(kāi)發(fā)期間發(fā)現(xiàn)峰對(duì)稱(chēng)、但柱效較低且連續(xù)進(jìn)樣RSD較大，建議評(píng)估溶劑效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

溶劑效應(yīng)具有一定的規(guī)律，如保留時(shí)間小的組分峰較易發(fā)生，多組分色譜圖中出峰較晚的組分峰型較好、減少進(jìn)樣量一般可減輕等，在實(shí)踐中可根據(jù)該規(guī)律對(duì)色譜行為異常是否為溶劑效應(yīng)進(jìn)行初步的判斷。

四、原理及解決方法

如上文所述，溶劑效應(yīng)為特定組分在稀釋劑與流動(dòng)相中所處狀態(tài)的差異對(duì)色譜行為的不利影響，差異主要包括洗脫能力、電離狀態(tài)、離子締合、互變平衡等。

（1）洗脫能力

這是目前一般意義上的理解，即上文提到的“純乙腈溶解樣品，注入流動(dòng)相為乙腈-水（18:82）的反相系統(tǒng)中，會(huì)造成峰分叉或拖尾的結(jié)果”。如果稀釋劑的洗脫能力大于流動(dòng)相，則可能導(dǎo)致溶劑效應(yīng)。

解決方法為調(diào)整稀釋劑或流動(dòng)相，使二者的洗脫能力接近或稀釋劑的洗脫能力低于流動(dòng)相。一般情況下，為避免洗脫能力導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)，反相色譜中較為穩(wěn)妥的做法是稀釋劑中有機(jī)相比例低于流動(dòng)相或相當(dāng)，必要時(shí)可略高于流動(dòng)相，但應(yīng)當(dāng)評(píng)估其溶劑效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，如根據(jù)上文提到的規(guī)律進(jìn)行判斷等。

（2）化合物的電離狀態(tài)

藥物活性成分很多都可以離子化，如苯磺酸氨氯地平、青霉素鉀等，這類(lèi)化合物絕大多數(shù)不是強(qiáng)電解質(zhì)，只能部分電離；即電離平衡中一部分是離子狀態(tài)另一部分是分子狀態(tài)，兩種狀態(tài)在固定相與流動(dòng)相的分配是不一樣的。在反相系統(tǒng)中，分子狀態(tài)與固定相結(jié)合更為緊密，保留更強(qiáng)；離子狀態(tài)則更傾向于流動(dòng)相，保留較弱。

設(shè)想一種情況，如果樣品為堿性化合物，稀釋劑為pH6.8緩沖鹽溶液（溶出曲線研究較為常見(jiàn)），流動(dòng)相為pH3.0的磷酸鹽溶液-有機(jī)相系統(tǒng)，這有非常大的可能導(dǎo)致明顯峰型異常的溶劑效應(yīng)。因?yàn)闃悠吩趐H6.8緩沖鹽溶液中的電離狀態(tài)遠(yuǎn)低于pH3.0的磷酸鹽溶液，供試品溶液與流動(dòng)相混合的過(guò)程中，需要一段時(shí)間將電離狀態(tài)從稀釋劑緩沖至流動(dòng)相的狀態(tài)，如因某些原因（稀釋劑是緩沖鹽、流動(dòng)相緩沖能力弱等）導(dǎo)致該時(shí)間較長(zhǎng)，則待測(cè)組分峰極可能出現(xiàn)明顯的峰型異常。

這種情況出現(xiàn)的溶劑效應(yīng)解決辦法一般有四種：更換稀釋劑使稀釋劑中待測(cè)物的電離狀態(tài)與流動(dòng)相一致或接近，減少進(jìn)樣量、在流動(dòng)相中加入反離子或者增加流動(dòng)相緩沖能力。

（3）離子締合

這種情況常見(jiàn)于由于待測(cè)物溶解性差在稀釋劑中含有十二烷基硫酸鈉的試驗(yàn)中，待測(cè)組分峰可能?chē)?yán)重變形，或者保留時(shí)間波動(dòng)非常大。如果待測(cè)物為堿性化合物，則其原因?yàn)殡x子狀態(tài)的待測(cè)物的陽(yáng)離子與十二烷基硫酸根陰離子形成離子締合物，該物質(zhì)在反相色譜中保留相對(duì)于待測(cè)物極大增強(qiáng)；而在流動(dòng)相中并不存在該締合物，流動(dòng)相消除該締合物的影響時(shí)間如果較長(zhǎng)，則會(huì)產(chǎn)生明顯的溶劑效應(yīng)。

簡(jiǎn)單的做法是更換稀釋劑，如稀釋劑不能更換，也可改變流動(dòng)相，如在流動(dòng)相中加入待測(cè)物的反離子，也形成離子締合物，減少待測(cè)物在稀釋劑與流動(dòng)相中的差異。

（4）互變平衡

對(duì)于在溶液中存在互變結(jié)構(gòu)的待測(cè)物，例如酮式烯醇式互變，如果在稀釋劑與流動(dòng)相中互變異構(gòu)狀態(tài)差異較大，也可能導(dǎo)致明顯的溶劑效應(yīng)。

（5）總結(jié)

上述差異導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)，根本原因是待測(cè)物在固定相-稀釋劑的分配系數(shù)與固定相-流動(dòng)相分配系數(shù)的較大差異導(dǎo)致的，是固定相、稀釋劑、流動(dòng)相三方博弈的結(jié)果。因此在評(píng)估溶劑效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)結(jié)合三方的具體情況進(jìn)行分析，對(duì)三方互相作用的力度進(jìn)行評(píng)估。解決溶劑效應(yīng)的上文未提到的方法就是改變固定相種類(lèi)，如將C18柱更換為CN柱，因?yàn)橄♂寗┡c流動(dòng)相中狀態(tài)的差異導(dǎo)致的分配系數(shù)的差異在CN柱中小于C18柱。

也就是說(shuō)，消除或者減少溶劑效應(yīng)的影響可以從稀釋劑、流動(dòng)相與固定相三個(gè)方面著手，使稀釋劑與流動(dòng)相性質(zhì)接近、減少稀釋劑用量；或者使流動(dòng)相與稀釋劑性質(zhì)接近、增強(qiáng)流動(dòng)相改變待測(cè)物狀態(tài)的能力；或者更改固定相種類(lèi)減少待測(cè)組分狀態(tài)差異對(duì)色譜行為的影響等。

稀釋劑的概念衍生出的依稀額溶劑效應(yīng)的特殊情況

本文所述稀釋劑為供試品溶液中除待測(cè)物外的所有組分，不能簡(jiǎn)單理解為用來(lái)溶解供試品的溶劑。在進(jìn)行溶劑效應(yīng)的評(píng)估不能只評(píng)估待測(cè)物在溶解用溶劑中的狀態(tài)與流動(dòng)相中狀態(tài)的差異，而應(yīng)該結(jié)合溶液中其他組分進(jìn)行評(píng)估。

設(shè)想如果開(kāi)發(fā)檢測(cè)某個(gè)堿性化合物中三殘留的方法，很可能出現(xiàn)的情況是單獨(dú)三峰型正常，和堿性化合物混合后三峰出現(xiàn)明顯異常。結(jié)合上文離子締合的相關(guān)內(nèi)容，我們能輕易作為判斷。但如果只從溶解用溶劑來(lái)理解檢測(cè)方法中的稀釋劑，則找不到問(wèn)題發(fā)生的原因。

因此在檢測(cè)供試品中某些雜質(zhì)的含量時(shí)，特別是高濃度供試品溶液，極可能供試品參與溶劑效應(yīng)的形成，原理參考上文相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行分析。

有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中單獨(dú)各組分圖譜峰型正常，混合溶液中出現(xiàn)峰型異常的組分峰也可以理解為其他組分參與了溶劑效應(yīng)的形成。

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