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賽默飛QS12k型實時熒光定量PCR儀如何使用

來源:杭州實了個驗生物科技有限公司   2025年02月06日 20:58  

賽默飛QS12k型實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)是賽默飛公司推出的一款高通量、高靈敏度的實時熒光定量PCR儀器,廣泛應(yīng)用于基因表達、基因分型、突變檢測以及病原檢測等分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。以下是關(guān)于如何使用該儀器的詳細步驟和注意事項。

1. 設(shè)備概述

QuantStudio 12K Flex PCR儀具備以下特點:

  • 高通量支持:支持12,000個樣品的實時PCR分析,適用于大規(guī)模數(shù)據(jù)采集。

  • 多通道熒光檢測:儀器支持最多6個熒光通道,可同時進行多重PCR反應(yīng),適用于多種熒光染料的檢測。

  • 靈活的實驗設(shè)置:支持多種實驗格式,包括96孔板、384孔板,滿足不同實驗需求。

  • 高精度熱循環(huán)系統(tǒng):精準的溫控系統(tǒng)和均勻的溫度分布,確保PCR反應(yīng)的一致性和可靠性。

2. 實驗準備

2.1 安裝與檢查

在開始使用QuantStudio 12K Flex PCR儀之前,需要確保設(shè)備已正確安裝并連接好所有必需的外部設(shè)備,包括電源、計算機(如果使用外部軟件進行數(shù)據(jù)分析)、網(wǎng)絡(luò)連接等。

  • 位置選擇:選擇一個穩(wěn)定的環(huán)境,避免設(shè)備受到電磁干擾、震動和溫度波動。

  • 儀器檢查:打開設(shè)備電源后,進行自檢,確保設(shè)備的硬件系統(tǒng)(如溫控系統(tǒng)、熒光檢測系統(tǒng)等)運行正常。

2.2 樣品和試劑準備

  • DNA模板:根據(jù)實驗的目的準備DNA模板。確保模板的純度和濃度適合定量PCR實驗。

  • 引物和探針:根據(jù)實驗的需求,設(shè)計和準備適合的引物和探針??梢允褂肨aqMan探針或者SYBR Green染料等。

  • PCR反應(yīng)體系:通常包括DNA模板、引物、探針、熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶等。

配制PCR反應(yīng)液時,應(yīng)根據(jù)所使用的試劑盒的說明書或具體實驗設(shè)計,確保反應(yīng)體系的準確性。

2.3 樣品加載

將PCR反應(yīng)混合物和模板加載到PCR板中,通常使用96孔板或384孔板。加載樣品時,應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,確保每個孔中反應(yīng)液的體積一致。

3. 設(shè)置實驗程序

3.1 創(chuàng)建新實驗

打開QuantStudio 12K Flex PCR儀的觸摸屏界面或通過計算機進行操作,選擇“新建實驗”并進入實驗設(shè)置界面。

  • 選擇反應(yīng)板類型:選擇96孔板、384孔板或其他適合實驗需求的板型。

  • 選擇熒光染料/探針:根據(jù)所使用的實驗體系,選擇適合的熒光通道和染料類型(如SYBR Green、TaqMan探針等)。QS12K支持最多6個熒光通道,因此可以進行多重PCR實驗。

3.2 設(shè)置熱循環(huán)程序

  • 熱啟動:根據(jù)所用的DNA聚合酶和試劑的要求,設(shè)置熱啟動步驟。通常在反應(yīng)的初期進行熱啟動,以確保DNA聚合酶激活并減少非特異性擴增。

  • 擴增程序:設(shè)置合適的PCR擴增循環(huán)程序,通常包括:

    • 變性步驟:通常在95°C下進行約15秒,目的是分開DNA雙鏈。

    • 退火步驟:根據(jù)引物的退火溫度(Tm值)設(shè)置退火溫度,通常在55-65°C范圍內(nèi),持續(xù)20-30秒。

    • 延伸步驟:在72°C下進行,通常每個循環(huán)延伸時間為30秒到1分鐘,具體時間取決于擴增片段的大小。

3.3 數(shù)據(jù)采集

在每個擴增循環(huán)的延伸階段或退火階段結(jié)束時進行熒光數(shù)據(jù)采集。設(shè)置合適的熒光檢測時間點,確保信號的準確捕捉。

3.4 啟動實驗

完成所有設(shè)置后,確認無誤后點擊“開始實驗”按鈕,啟動實時PCR實驗。

4. 實驗過程中監(jiān)測

在實驗進行過程中,QuantStudio 12K Flex PCR儀會實時顯示PCR擴增曲線、熒光信號強度變化等數(shù)據(jù)。用戶可以通過設(shè)備的顯示界面實時監(jiān)控實驗進度。

  • 擴增曲線:隨著PCR反應(yīng)的進行,熒光信號會逐漸增強,用戶可以看到擴增曲線的變化。在適當?shù)臅r間點,熒光信號超過背景信號時,稱為“閾值周期”(Ct值)。Ct值的大小與初始模板的數(shù)量成反比。

  • 反應(yīng)板監(jiān)控:如果使用多孔板,可以查看每個孔的實時擴增曲線,方便了解每個樣品的反應(yīng)情況。

5. 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果

5.1 Ct值的確定

通過實時熒光信號的監(jiān)測,可以獲得每個樣品的Ct值。Ct值代表熒光信號達到閾值時的循環(huán)數(shù),是反應(yīng)效率的一個重要指標。

  • 低Ct值表示樣品中目標DNA的初始量較高。

  • 高Ct值表示樣品中目標DNA的初始量較低。

5.2 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與分析

完成實驗后,用戶可以通過設(shè)備的分析軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù)并生成實驗報告。QuantStudio 12K Flex PCR儀支持多種數(shù)據(jù)分析功能,如:

  • 標準曲線分析:根據(jù)標準品的Ct值與已知濃度構(gòu)建標準曲線,計算樣品中目標基因的拷貝數(shù)。

  • 相對定量分析:使用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析,比較不同樣本間目標基因的表達量。

  • 多重PCR分析:如果進行多重PCR實驗,可以同時分析多個目標基因的表達或檢測多個突變。

5.3 報告生成

分析完畢后,用戶可以生成實驗報告,報告包括各個樣品的Ct值、擴增曲線、標準曲線、相對定量數(shù)據(jù)等內(nèi)容。

6. 注意事項與故障排除

6.1 常見問題

  • 擴增失敗或Ct值異常高:可能由于模板DNA濃度過低、引物設(shè)計不當、PCR反應(yīng)體系問題等導(dǎo)致。檢查樣品質(zhì)量和反應(yīng)體系,必要時優(yōu)化引物設(shè)計。

  • 非特異性擴增:出現(xiàn)非特異性擴增可能是由于引物退火溫度設(shè)置不合適??梢酝ㄟ^提高退火溫度來提高特異性。

  • 熒光信號不穩(wěn)定:檢查熒光染料的濃度是否合適,避免反應(yīng)液中有氣泡,氣泡可能導(dǎo)致信號的偏差。

6.2 清潔與維護

定期清潔PCR儀器,保持熒光檢測窗口的清潔,避免灰塵或污染影響熒光信號的準確性。

7. 總結(jié)

QuantStudio 12K Flex實時熒光定量PCR儀具有高度的靈活性和高通量能力,適合多種分子生物學(xué)實驗的需求。通過合適的實驗設(shè)計、反應(yīng)體系優(yōu)化和數(shù)據(jù)分析,能夠獲得準確、可靠的實驗結(jié)果。在使用時,確保設(shè)備、試劑、樣品和程序設(shè)置的正確性,以獲得實驗效果。


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