讓細(xì)胞帶上“馬克筆”——精準(zhǔn)標(biāo)記腫瘤抗原特異性T細(xì)胞

原創(chuàng)：Bicycle 來(lái)源：細(xì)胞基因研究圈

今天來(lái)給大家講講2020 年 Scripps 研究所的 Wu Peng 等人在 Cell 上發(fā)表的一篇超厲害的文章！他們搞出了個(gè)超有創(chuàng)意的 (GDP - 巖藻糖 - 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶) GDP-Fuc-FT 綴合物，這玩意兒可牛啦，能自己給自己 “加戲”，把巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶裝到細(xì)胞表面 ，就像給細(xì)胞貼上了一個(gè)神奇的 “小標(biāo)簽”，用來(lái)探測(cè)細(xì)胞和細(xì)胞之間的互動(dòng)，更絕的是，還能精準(zhǔn)找到腫瘤抗原特異性 T 細(xì)胞，簡(jiǎn)直是細(xì)胞界的 “火眼金睛”！

全文速覽：腫瘤特異性抗原反應(yīng)性 T 細(xì)胞（TSA-reactive T cells）在免疫檢查點(diǎn)抑制療法和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療里，那可是妥妥的 C 位擔(dān)當(dāng)。但尷尬的是，由于 TSA 反應(yīng)性 T 細(xì)胞太 “調(diào)皮”，有著各種各樣的特性，目前還沒(méi)有一個(gè)靠譜的 “身份牌” 能專門把它們這群細(xì)胞給認(rèn)出來(lái)。這篇文章就搞出了個(gè) FucoID（Fucosyl-Biotinylation），這可是檢測(cè)內(nèi)源性抗原特異性 T 細(xì)胞的 “萬(wàn)能小助手”。它用了一種特別的糖基化標(biāo)記方法，就像給 TSA 反應(yīng)性 T 細(xì)胞穿上了一件du特的 “花衣裳”，只有它們能穿上，這樣就能把它們和其他 “打醬油” 的旁觀者 T 細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，成功 “揪” 出它們啦。FucoID 可厲害啦，能在腫瘤里找到 TSA 反應(yīng)性 CD4+、CD8+ T 細(xì)胞，還有 TSA 抑制性 CD4+ T 細(xì)胞，并且把它們和那些在旁邊 “看熱鬧” 的旁觀者 T 細(xì)胞分清楚。研究還發(fā)現(xiàn)，和那些旁觀者 TIL 比起來(lái)，TSA 反應(yīng)性 T 細(xì)胞有著不一樣的 T 細(xì)胞受體（TCR）庫(kù)，還有自己du特的 “基因密碼”。另外，雖然 TSA 反應(yīng)性 CD8+ TIL 看起來(lái)有點(diǎn) “功能失調(diào)”，像是沒(méi)睡醒的樣子，但人家可是深藏不露，有著chao強(qiáng)的增殖能力和腫瘤特異性殺傷能力，妥妥的 “扮豬吃老虎”！

全文詳解

背景 & 設(shè)計(jì)：在過(guò)去十年里，免疫檢查點(diǎn)抑制劑和基于細(xì)胞轉(zhuǎn)移（ACT）療法就像兩個(gè) “超級(jí)英雄”，給癌癥治療帶來(lái)了大變革。但可惜的是，這兩個(gè) “英雄” 的威力有限，只對(duì)少數(shù)患者和癌癥類型起作用。要想成功發(fā)起抗腫瘤免疫反應(yīng)，就全靠腫瘤特異性抗原（TSA）反應(yīng)性 T 細(xì)胞 “重振旗鼓”，重新激活和大量繁殖啦。但腫瘤微環(huán)境和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）太 “復(fù)雜多變”，導(dǎo)致患者對(duì)免疫療法的反應(yīng)也捉摸不定。TILs 里可不只有對(duì) TSA 有反應(yīng)的 T 細(xì)胞，還有一群識(shí)別非腫瘤抗原的旁觀者 T 細(xì)胞在 “搗亂”。所以，找出 TSA 反應(yīng)性 T 細(xì)胞對(duì)預(yù)測(cè)和治療那可是至關(guān)重要。雖然可以通過(guò)檢測(cè)表面標(biāo)記物（比如 PD-1）從腫瘤消化物里大概富集出腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞，但那些 “狡猾” 的旁觀者 T 細(xì)胞也可能會(huì) “冒充”，表達(dá)同樣的標(biāo)記物。傳統(tǒng)方法通過(guò)反向免疫學(xué)和全外顯子測(cè)序（WES）來(lái)找 TSA，然后再用計(jì)算工具預(yù)測(cè) T 細(xì)胞反應(yīng)性。這一套操作下來(lái)，不僅耗時(shí)久，而且準(zhǔn)確性也不咋地。不過(guò)別怕，本文作者開(kāi)發(fā)出了 FucoID 方法，不用提前知道 TSA 是啥，就能把抗原特異性 T 細(xì)胞給找出來(lái)。這個(gè)方法靠著腫瘤相關(guān)的 DC 細(xì)胞引導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，用糖基化標(biāo)記，也就是巖藻糖基化 - 生物素，給 TSA 反應(yīng)性 T 細(xì)胞做上標(biāo)記，然后就能把它們從旁觀者 T 細(xì)胞里 “拎” 出來(lái)啦。想知道作者具體是怎么做到這么巧妙的操作嗎？接著往下看！

研究?jī)?nèi)容：看下面這個(gè)圖 A，作者之前開(kāi)發(fā)的化學(xué)酶法可神奇了，能把重組蛋白 “粘” 到細(xì)胞表面。這個(gè)方法用了 α(1,3) FT，就像一個(gè) “快遞員”，能快速又準(zhǔn)確地把蛋白從它的天然供體底物 GDP - 巖藻糖（GDP - Fuc）送到細(xì)胞表面的 LacNAc（或者唾液酸化 LacNAc）上（推薦閱讀：NK 細(xì)胞搭載追蹤器精準(zhǔn)查殺腫瘤！—— 一步化學(xué)酶法構(gòu)建 Antibody?Cell Conjugates）。因?yàn)?LacNAc 和唾液酸化 LacNAc 在好多細(xì)胞表面都有，像樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）和 T 細(xì)胞，所以這個(gè)方法就能用來(lái)給免疫細(xì)胞的表面 “改裝” 啦?；谶@個(gè)技術(shù)，作者就想著把 FT 弄到細(xì)胞表面，用這個(gè) “固定在細(xì)胞膜上的小zhen探” FT 來(lái)探測(cè)細(xì)胞和細(xì)胞之間的互動(dòng)，看下面這個(gè)圖 B。

首先，他們合成了一個(gè)小分子 - 蛋白綴合物，叫 GDP - 巖藻糖 - FT（GDP - Fuc - FT），這東西可有意思了，同時(shí)帶著供體底物和糖基轉(zhuǎn)移酶，就像一個(gè) “多功能小包裹”。研究者把目標(biāo)細(xì)胞和這個(gè) GDP - Fuc - FT 放在一起 “培養(yǎng)感情”，這個(gè)酶就開(kāi)始自己 “干活”，把 Fuc - FT 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面被 LacNAc 修飾的糖鏈上。

接著，作者就想驗(yàn)證一下 FT 功能化的細(xì)胞能不能通過(guò) “親密接觸”，把標(biāo)記物（比如巖藻糖 - 生物素，F(xiàn)uc - Bio）轉(zhuǎn)移到和它接觸的細(xì)胞上，看下面這個(gè)圖。在實(shí)驗(yàn)里，作者把 FT 功能化的 CHO 細(xì)胞和野生型 CHO 細(xì)胞放在一起培養(yǎng)，還加了 GDP - Fuc - Bio 來(lái)做標(biāo)記。用熒光顯微鏡一看，哇塞，和 FT 功能化的 CHO 細(xì)胞 “貼貼” 的 CHO 細(xì)胞在接觸的地方出現(xiàn)了chao強(qiáng)烈的標(biāo)記，而那些沒(méi) “貼貼” 的 CHO 細(xì)胞就干干凈凈，一點(diǎn)標(biāo)記都沒(méi)有。這就說(shuō)明 FT 在細(xì)胞之間接觸的時(shí)候真的能把標(biāo)記物送過(guò)去，而且只給 “貼貼” 的細(xì)胞做標(biāo)記哦。

然后，他們就用 FucoID 技術(shù)來(lái)看看抗原特異性的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和 T 細(xì)胞之間是怎么 “互動(dòng)” 的。

首先，研究者把 FT 修飾的不成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（iDCs）和來(lái)自 OT - I 轉(zhuǎn)基因小鼠的 CD8+ T 細(xì)胞放在一起培養(yǎng)，看上面這個(gè)圖，這些小鼠的 TCR 能專門識(shí)別 OVA 肽段 OVA257–264。然后把 iDCs 用 OVA 肽段 OVA257–264 激活，再和 OT - I CD8+ T 細(xì)胞一起培養(yǎng)，還加了 GDP - 巖藻糖 - 生物素（GDP - Fuc - Bio）來(lái)做標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和 iDCs “對(duì)上眼” 結(jié)合在一起的 OT - I CD8+ T 細(xì)胞被標(biāo)記得超明顯，而那些沒(méi) “互動(dòng)” 的細(xì)胞就只有很低的背景標(biāo)記，看下面這個(gè)圖。而且，用 LCMV GP33–41 肽段處理的 iDCs 就只引發(fā)了很低的背景標(biāo)記，這就說(shuō)明 FucoID 的標(biāo)記是有抗原特異性的，可不是隨便亂標(biāo)記哦。

接著，作者又進(jìn)一步驗(yàn)證了 FucoID 在更復(fù)雜的細(xì)胞 “大雜燴” 里對(duì)抗原特異性標(biāo)記的本事。他們把用 OVA257–264 和 LCMV GP33–41 分別激活的 iDCs 和 OT - I、P14 CD8+ T 細(xì)胞混在一起培養(yǎng)，看下面這個(gè)圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，iDCs 很厲害地根據(jù)抗原特異性把 OT - I 和 P14 CD8+ T 細(xì)胞都標(biāo)記好了，這就說(shuō)明 FucoID 的敏感性和特異性都超棒！

最后，作者在 B16 - OVA 黑色素瘤模型里測(cè)試這個(gè) FucoID 技術(shù)。把 B16 - OVA 腫瘤 “打散” 做成單細(xì)胞懸液，然后和用 B16 - OVA 腫瘤裂解物激活的 iDC - FT 放在一起培養(yǎng)，看下面這個(gè)圖。

加了 GDP - Fuc - Bio 之后，iDC - FT 能把 57% 的 CD8+ TILs 都標(biāo)記上。而沒(méi)激活的 iDC - FT 就只能標(biāo)記極少量的 CD8+ TILs（不到 2%）。另外，76% 的 CD8+ TILs 都表達(dá) PD - 1，其中 74% 都被 iDC - FT 標(biāo)記了，這就說(shuō)明這部分細(xì)胞很可能就是 TSA 反應(yīng)的 T 細(xì)胞。沒(méi)被標(biāo)記的 PD - 1+ TILs 可能就是那些 “打醬油” 的旁觀者細(xì)胞。PD - 1 陰性 T 細(xì)胞里只有大概 3% 被標(biāo)記，這就意味著幾乎所有 TSA 反應(yīng)的 T 細(xì)胞都已經(jīng)和它們對(duì)應(yīng)的抗原 “見(jiàn)過(guò)面” 啦，看下面這個(gè)圖。

為了看看不同亞群在 OVA 刺激下能不能重新 “壯大隊(duì)伍”，形成記憶，作者還把這些 TILs 分別轉(zhuǎn)移到?jīng)]有抗原的 C57BL/6J 小鼠身體里。過(guò)了一天，就給這些 “二次宿主” 小鼠用表達(dá) OVA 的單核細(xì)胞增生性李斯特菌（LM - OVA）進(jìn)行免疫。到第 8 天的時(shí)候，在血液里就能看到 PD - 1+Bio + 細(xì)胞大量增加，而 PD - 1+Bio–和 PD - 1–細(xì)胞就增加得很少。到第 38 天，在脾臟里還能檢測(cè)到大概 0.2% 的 PD - 1+Bio+ T 細(xì)胞，而且大部分都是四聚體陽(yáng)性細(xì)胞。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，這些轉(zhuǎn)移的 T 細(xì)胞在再次遇到抗原的時(shí)候還能再一次大量繁殖，這就證明了它們有著抗原特異性記憶功能。

總結(jié)展望：腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TILs）里可不單純，不僅有針對(duì)腫瘤抗原的 T 細(xì)胞，還有一群識(shí)別其他和癌癥沒(méi)啥關(guān)系的表位（比如病毒抗原）的旁觀者 CD8+ TILs 在里面 “湊熱鬧”。這些旁觀者細(xì)胞在外表上和腫瘤抗原特異性 T 細(xì)胞有點(diǎn)像，但它們對(duì)腫瘤可不 “感冒”。FucoID 方法就像一個(gè) “公平公正的裁判”，通過(guò)直接的 TCR - pMHC 相互作用生成選擇標(biāo)記（比如生物素），提供了一種不偏不倚的 TSA 反應(yīng)性 TIL 識(shí)別方法。通過(guò)這個(gè)方法，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的旁觀者 T 細(xì)胞亞群（PD - 1+Bio– TILs），它們的轉(zhuǎn)錄組特征和之前報(bào)道的旁觀者 PD - 1–CD8+ T 細(xì)胞可不一樣。這就說(shuō)明 FucoID 能找到一些傳統(tǒng)方法（比如四聚體染色和功能標(biāo)記）很難發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。

FucoID 的出現(xiàn)可幫了大忙了，研究人員能用它直接把 TSA 反應(yīng)性 T 細(xì)胞 “收集” 起來(lái)，進(jìn)行擴(kuò)增，還能快速分離出相關(guān)的 TCR 來(lái)評(píng)估功能，這樣就能大大縮短研究時(shí)間，降低成本。所以，作為第一種基于糖基轉(zhuǎn)移酶開(kāi)發(fā)的細(xì)胞間相互作用探針的方法，F(xiàn)ucoID 不用進(jìn)行復(fù)雜的基因操作，操作簡(jiǎn)單又方便，這就意味著它在臨床環(huán)境里用來(lái)檢測(cè)和分離人類 TSA 反應(yīng)性 TILs 有著很大的潛力。它肯定能加快 TSA 反應(yīng)性 TIL 及其 TCR 的發(fā)現(xiàn)，以后個(gè)性化癌癥治療的成本說(shuō)不定就能降下來(lái)，更多患者也能受益啦！