血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)染促內(nèi)皮細胞新生血管形成研究

摘要

本研究探討了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）轉(zhuǎn)染對促進內(nèi)皮細胞新生血管形成的影響。通過構(gòu)建VEGF基因表達載體，利用威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）。實驗結(jié)果表明，VEGF轉(zhuǎn)染顯著提高了內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成能力。Western blot和qPCR分析證實VEGF表達水平顯著上調(diào)。本研究為VEGF基因治療在缺血性疾病中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

引言

血管新生是許多生理和病理過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在組織修復(fù)、腫瘤生長和缺血性疾病中發(fā)揮重要作用。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）作為有效的促血管生成因子之一，能夠直接刺激內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成。近年來，基因治療技術(shù)的發(fā)展為VEGF在缺血性疾病中的應(yīng)用提供了新的思路。本研究旨在探討VEGF基因轉(zhuǎn)染對內(nèi)皮細胞新生血管形成能力的影響，為VEGF基因治療的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

一、材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用威尼德電穿孔儀進行VEGF基因轉(zhuǎn)染。將構(gòu)建好的VEGF表達載體與HUVECs混合，設(shè)置電穿孔參數(shù)為電壓200 V，脈沖寬度10 ms，脈沖次數(shù)1次。轉(zhuǎn)染后細胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時用于后續(xù)實驗。

1.2 細胞增殖實驗

采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的HUVECs接種于96孔板，每孔5×103個細胞。分別在24、48、72小時加入CCK-8溶液，37℃孵育2小時后，使用酶標儀測定450 nm處吸光度值。

1.3 細胞遷移實驗

采用Transwell小室法檢測細胞遷移能力。將2×104個轉(zhuǎn)染后的HUVECs接種于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24小時后，用棉簽擦去上室未遷移細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。隨機選取5個視野計數(shù)遷移細胞數(shù)。

1.4 管狀結(jié)構(gòu)形成實驗

將100 μL Matrigel基質(zhì)膠鋪于96孔板，37℃凝固30分鐘。將轉(zhuǎn)染后的HUVECs以2×104個/孔接種于Matrigel上，培養(yǎng)6小時后觀察管狀結(jié)構(gòu)形成情況。使用倒置顯微鏡隨機選取5個視野拍照，Image J軟件分析管狀結(jié)構(gòu)長度和分支點數(shù)。

1.5 Western blot檢測

收集轉(zhuǎn)染后的HUVECs，裂解提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1小時。加入VEGF一抗（1:1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP標記的二抗（1:5000）室溫孵育1小時。ECL顯色，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）

使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green法進行qPCR檢測。VEGF引物序列：上游5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3'，下游5'-TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30秒；95℃ 5秒，60℃ 30秒，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

2.1 VEGF轉(zhuǎn)染對HUVECs增殖的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，VEGF轉(zhuǎn)染組HUVECs在24、48、72小時的增殖能力均顯著增強（P<0.05）。24小時時，VEGF轉(zhuǎn)染組吸光度值為0.45±0.03，對照組為0.38±0.02；48小時時，VEGF轉(zhuǎn)染組為0.78±0.05，對照組為0.62±0.04；72小時時，VEGF轉(zhuǎn)染組達到1.12±0.07，對照組為0.89±0.05。結(jié)果表明VEGF轉(zhuǎn)染顯著促進了HUVECs的增殖。

2.2 VEGF轉(zhuǎn)染對HUVECs遷移的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組遷移細胞數(shù)為（125.3±8.7）個/視野，顯著高于對照組的（78.6±6.2）個/視野（P<0.01）。這表明VEGF轉(zhuǎn)染顯著增強了HUVECs的遷移能力。

2.3 VEGF轉(zhuǎn)染對HUVECs管狀結(jié)構(gòu)形成的影響

Matrigel實驗結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組HUVECs形成的管狀結(jié)構(gòu)更加完整，分支更多。定量分析顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組管狀結(jié)構(gòu)總長度為（3256.8±256.3）μm，顯著高于對照組的（2187.5±198.4）μm（P<0.01）；分支點數(shù)為（28.3±2.1）個/視野，顯著高于對照組的（18.7±1.8）個/視野（P<0.01）。這表明VEGF轉(zhuǎn)染顯著促進了HUVECs的管狀結(jié)構(gòu)形成能力。

2.4 Western blot檢測VEGF蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白表達水平顯著高于對照組（P<0.01）?；叶戎捣治鲲@示，VEGF轉(zhuǎn)染組VEGF蛋白表達量為對照組的2.8倍。這表明VEGF基因成功轉(zhuǎn)染并表達。

2.5 qPCR檢測VEGF mRNA表達

qPCR結(jié)果顯示，VEGF轉(zhuǎn)染組VEGF mRNA相對表達量為8.35±0.67，顯著高于對照組的1.00±0.12（P<0.01）。這表明VEGF基因在mRNA水平上也成功表達。

三、討論

本研究通過VEGF基因轉(zhuǎn)染HUVECs，系統(tǒng)評估了VEGF對內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響。實驗結(jié)果表明，VEGF轉(zhuǎn)染顯著促進了HUVECs的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，這與其在血管生成中的關(guān)鍵作用一致。Western blot和qPCR結(jié)果證實VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表達，為后續(xù)的功能實驗提供了基礎(chǔ)。

VEGF促進血管新生的機制可能涉及多個方面。首先，VEGF能夠直接刺激內(nèi)皮細胞增殖，增加內(nèi)皮細胞數(shù)量，為新生血管形成提供細胞基礎(chǔ)。其次，VEGF可增強內(nèi)皮細胞的遷移能力，促進內(nèi)皮細胞向缺血或損傷部位聚集。最后，VEGF能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞形成管狀結(jié)構(gòu)，這是血管生成的關(guān)鍵步驟。本研究的結(jié)果與這些機制相符，進一步證實了VEGF在血管生成中的重要作用。

本研究的創(chuàng)新之處在于采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)實現(xiàn)VEGF的過表達，避免了外源性VEGF蛋白半衰期短、穩(wěn)定性差的問題。同時，使用威尼德電穿孔儀進行轉(zhuǎn)染，提高了轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)實驗的順利進行提供了保障。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，僅在細胞水平進行了研究，缺乏動物實驗驗證；未探討VEGF轉(zhuǎn)染對其他血管生成相關(guān)因子的影響。未來研究可進一步在動物模型中驗證VEGF基因治療的效果，并探討其分子機制。

四、結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了VEGF基因表達載體，并通過威尼德電穿孔儀將其轉(zhuǎn)染至HUVECs。實驗結(jié)果表明，VEGF轉(zhuǎn)染顯著提高了內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成能力。Western blot和qPCR分析證實VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表達。這些發(fā)現(xiàn)為VEGF基因治療在缺血性疾病中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，具有重要的臨床意義。未來研究可進一步探討VEGF基因治療的長期效果和安全性，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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