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酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是一種常用的基于抗原和抗體之間特異性鍵的分析免疫化學(xué)測定。ELISA實驗優(yōu)化過程中應(yīng)測試許多因素，例如用于包衣的抗原或抗體的濃度、溫度、各個步驟的持續(xù)時間、包被緩沖液的類型，例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或碳酸鹽緩沖液、樣品制備方法。那么我們該如何優(yōu)化ELISA實驗呢？讓我們一起來看看吧！
1. 抗原涂層
① ELISA的第一步是用抗原包被孔或捕獲抗體。
?、?大多數(shù)情況下，這包括將PBS或碳酸鹽緩沖液中的蛋白質(zhì)溶液應(yīng)用于微量滴板孔。用于包被蛋白質(zhì)的微量滴定板是具有改性表面的特殊板，即對具有極性或親水基團(tuán)的分子具有高親和力的高電荷聚苯乙烯表面。
2. 飽和阻斷
?、?用抗原涂覆ELISA板的過程依賴于孔固相的結(jié)合活性，該固相將生物分子固定在孔表面。之后的步驟是阻塞。在封閉過程中，孔底部的游離結(jié)合位點被封閉緩沖液飽和，以防止非特異性結(jié)合的可能性和孔的殘余結(jié)合能力，從而大大提高信噪比和特異性。如果不進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆忾]，檢測抗體可能會與抗原非特異性結(jié)合，導(dǎo)致高背景信號和低靈敏度。
?、?每個封閉緩沖區(qū)都代表了減少背景和保持特異性之間的折衷方案。在某些情況下，全血清和血清蛋白白蛋白可引起非特異性ELISA信號。
3. 樣品制備
稀釋劑的選擇很重要。通常，標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑應(yīng)盡可能與樣品的基質(zhì)相似。
?、?例如，含BSA的PBS是ELISA中良好的血清替代品，常用于生物學(xué)樣品。下一個重要的稀釋劑成分是非離子去污劑(吐溫20、TritonX-100、CHAPS)，在低濃度下，可防止非特異性(疏水性)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。特異性結(jié)合通常對洗滌劑更具抵抗力。
② 如果分析物不是血清，則可能需要選擇與PBS/Tween/BSA不同的稀釋劑。在這種情況下，有必要檢查實驗樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋線性。其原因是標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑或matix的成分對抗原/抗體相互作用的影響。在這種情況下，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)回收或線性稀釋實驗。
?、?加標(biāo)回收：將一定量的標(biāo)準(zhǔn)品加入(加標(biāo))到樣品緩沖液或樣品中，并與未添加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品同時測量。可以比較添加到天然測試樣品基質(zhì)中的相同量的分析物和添加到標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑中的相同加標(biāo)值。
④ 在測試實驗樣品時，重要的是測試幾種稀釋液，全部一式兩份或一式三份，并結(jié)合已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行，以確保最終結(jié)果落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分內(nèi)。
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