EPAS1 通過內(nèi)皮脂肪酸攝取減輕血流紊亂區(qū)域動脈粥樣硬化的發(fā)生

EPAS1 Attenuates Atherosclerosis Initiation at Disturbed Flow Sites Through Endothelial Fatty Acid Uptake

Keywords: atherosclerosis; diet, high-fat; endothelial cells; obesity; plaque, atherosclerotic.

動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展不穩(wěn)定，在暴露于血流紊亂的動脈區(qū)域堆積。這些血流動力學(xué)條件產(chǎn)生低幅度和振蕩方向的機(jī)械壁剪切應(yīng)力，誘導(dǎo)局部內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）功能障礙，從而驅(qū)動斑塊形成。全球流行的肥胖與代謝異常有關(guān)，包括血脂異常和高血糖，這些都是動脈粥樣硬化的驅(qū)動因素。血流紊亂會增加 EC 對血脂異常和高血糖的敏感性，然而，這種聯(lián)系背后的分子機(jī)制仍然知之甚少。

內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的維持依賴于調(diào)節(jié)代謝平衡的轉(zhuǎn)錄因子之間錯綜復(fù)雜的相互作用。值得注意的是，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）轉(zhuǎn)錄因子 HIF1A 和 HIF2A（EPAS1）在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著核心作用。EPAS1 在血管生物學(xué)中的功能研究較少。已知 EPAS1 通過穩(wěn)定新生微血管網(wǎng)絡(luò)和驅(qū)動動脈生成來促進(jìn)血管形成。EPAS1 還調(diào)節(jié)其他幾種生理過程，包括胚胎發(fā)生、紅細(xì)胞生成、腫瘤發(fā)生和肝臟代謝。然而，EPAS1 在動脈穩(wěn)態(tài)、 EC 機(jī)械反應(yīng)和動脈粥樣硬化中的潛在作用仍不清楚。

最近，英國謝菲爾德大學(xué)轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)研究所、倫敦帝國理工學(xué)院國家心肺研究所及瑞士蘇黎世大學(xué)醫(yī)院臨床化學(xué)研究所等聯(lián)合團(tuán)隊(duì)研究了 EPAS1 在動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用，特別是在血流紊亂的區(qū)域。研究證明 EPAS1 在這些區(qū)域富集，通過促進(jìn)脂肪酸代謝以增強(qiáng)內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)來限制動脈粥樣硬化，并將 EPAS1 確立為肥胖與內(nèi)皮對剪切應(yīng)力反應(yīng)之間的關(guān)鍵中間環(huán)節(jié)，揭示了肥胖、血流紊亂和動脈粥樣硬化聯(lián)系的復(fù)雜分子機(jī)制。研究成果發(fā)表在 Circulation Research 期刊題為“EPAS1 Attenuates Atherosclerosis Initiation at Disturbed Flow Sites Through Endothelial Fatty Acid Uptake”。

首先，為了分析 EPAS1 是否對血流有響應(yīng)，使用體外平行板系統(tǒng)將豬主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（PAEC）暴露于不同剪切應(yīng)力條件培養(yǎng)72 h：高剪切應(yīng)力（HSS，13 dynes/cm2）、低剪切應(yīng)力（LSS，4 dynes/cm2）或低振蕩剪切應(yīng)力（LOSS，4 dynes/cm2，1 Hz，雙向）。免疫印跡顯示，與LSS或單向HSS 相比，暴露于 LOSS的 EPAS1 表達(dá)增加（圖1 A）。然后，測量了小鼠主動脈弓 EC 中的 EPAS1 水平，與外曲率相比，內(nèi)曲率暴露于相對較低的時(shí)間-平均 WSS 幅度和更多的振蕩區(qū)（即 LOSS）（圖1 B）。與體外研究結(jié)果一致，小鼠主動脈免疫熒光染色顯示，與 HSS 區(qū)域相比，EPAS1 在 LOSS 區(qū)域（內(nèi)曲率）顯著富集（圖1 C）。LOSS 位點(diǎn)的 EPAS1 一部分定位于細(xì)胞核，表明它是活躍的（圖1 C）。因此，EPAS1 在體外被 LOSS 增強(qiáng)，并在暴露于 LOSS 的小鼠主動脈的動脈粥樣硬化區(qū)域富集。

為了評估肥胖對主動脈內(nèi)皮 EPAS1 水平的影響，將 WT 小鼠暴露于高脂或正常飲食條件 22 周。主動脈弓的表面染色顯示，與正常喂養(yǎng)的對照小鼠相比，暴露于 HFD 的小鼠 LOSS 區(qū)域的 EPAS1 水平顯著降低。因此，與肥胖相關(guān)的 HFD 喂養(yǎng)會降低 LOSS 動脈粥樣硬化易感區(qū)域的 EPAS1 表達(dá)。

隨后，研究人員試圖確定肥胖下 EPAS1 降低的機(jī)制，并重點(diǎn)關(guān)注了肥胖中代謝變化對 EPAS1 表達(dá)的影響。通過給小鼠注射鏈脲佐菌素鏈（STZ）誘導(dǎo)糖尿病疾病模型，表面染色顯示，在STZ處理的小鼠中，主動脈 LOSS 區(qū)域的 EPAS1 表達(dá)沒有改變，表明高血糖不足以抑制 EPAS1。

圖1    EPAS1在暴露于低剪應(yīng)力和振蕩剪應(yīng)力下的動脈粥樣硬化易感性部位富集。

接下來，通過用蘿卜硫素（Sulforaphane）處理肥胖小鼠來分析高脂血癥在 EPAS1 抑制中的潛在作用。蘿卜硫素已知可以改變脂質(zhì)譜和保護(hù)內(nèi)皮。結(jié)果表明，蘿卜硫素顯著降低了暴露于 HFD 肥胖小鼠血漿中甘油三酯（TGs）水平（圖2 A），而血糖（圖2 B）、體重和血漿總膽固醇水平、HDL（高密度脂蛋白）和 LDL/VLDL（低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白）水平?jīng)]有顯著改變。蘿卜硫素處理還恢復(fù)了 EPAS1 在 LOSS 區(qū)域的表達(dá)，并適度提高來其在 HSS 區(qū)域的表達(dá)（圖2 C）。

在 SFN 處理的肥胖小鼠中，EPAS1 的恢復(fù)可能與血漿 TG 降低相關(guān)，因此，假設(shè) TGs 可能參與肥胖中 EPAS1 的抑制，將在 LOSS 下培養(yǎng)的 PAEC 暴露于游離脂肪酸（FFAs）來進(jìn)行驗(yàn)證。免疫印跡顯示，暴露于油酸（OA）或棕櫚酸（PA）后 EPAS1 水平顯著降低。為了研究潛在機(jī)制，對靶向 EPAS1 的 PHD2 和 PHD3 蛋白進(jìn)行降解。PA 或 OA 顯著增加 PHD2 水平，表明 FFAs 可能通過誘導(dǎo) PHD2 降低 EPAS1。通過主動脈表面染色得到進(jìn)一步驗(yàn)證，與非肥胖小鼠相比，喂食 HFD 的肥胖小鼠在 LOSS 區(qū)域的 PHD2 表達(dá)增強(qiáng)。

蘿卜硫素可以通過激活核因子 NRF2 和抑制活性氧對 EC 產(chǎn)生直接影響。因此，在存在或不存在蘿卜硫素或抗氧化劑 NAC 的情況下用PA或 OA 處理 PAEC 來研究該通路在 EPAS1 挽救中的潛在參與。蘿卜硫素和 NAC 增加了與 PA 或 OA 共處理的 PAEC 中的平均 EPAS1 水平，盡管沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但不能排除 SFN 通過減少活性氧來挽救 FFA 介導(dǎo)的 EPAS1 抑制的可能性。此外，該機(jī)制可能涉及抑制 PHD2，其被 SFN 和 NAC 降低。因此，蘿卜硫素處理的肥胖小鼠中 EPAS1 的恢復(fù)可能涉及 SFN 對內(nèi)皮的直接作用。這些觀察結(jié)果表明，EPAS1 在肥胖中的降低可能是由于高甘油三酯血癥-FFA 代謝與細(xì)胞氧化應(yīng)激的局部改變相結(jié)合，導(dǎo)致內(nèi)皮 PHD2 的誘導(dǎo)。

圖2     蘿卜硫素可挽救肥胖小鼠的 EPAS1水平。

進(jìn)一步地，還評估了是否可以在血清和外周微血管系統(tǒng)中觀察到肥胖中的 EPAS1 抑制，發(fā)現(xiàn)小鼠肥胖導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細(xì)胞中 EPAS1 降低，同時(shí)循環(huán)血清 EPAS1 也減少。

通過比較肥胖和非肥胖個(gè)體的 PHD-EPAS1 通路來評估研究結(jié)果的臨床相關(guān)性。ELISA 結(jié)果顯示，EPAS1 在所有非肥胖對照的血清樣本中均可檢測到，但在肥胖個(gè)體中缺失或顯著減少。然后，研究了臨床肥胖患者血清 EPAS1 降低是否與循環(huán)脂質(zhì)和 ROS 改變有關(guān)。與非肥胖個(gè)體相比，肥胖者的 FFAs 水平略有增加，但卻沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肥胖組和非肥胖組之間血清的總抗氧化能力相似。肥胖患者和非肥胖對照組皮下脂肪中分離的微血管 EC 中 EPAS1、PHD2 和 PHD3 轉(zhuǎn)錄物的定量實(shí)時(shí) PCR 顯示，與對照組相比，肥胖個(gè)體的 PHD2 和 PHD3 水平顯著增加，而 EPAS1 mRNA 表達(dá)沒有改變。這些數(shù)據(jù)表明，EPAS1 在與血脂異常以及 EC 中 PHD2 和 PHD3 表達(dá)升高相關(guān)的肥胖個(gè)體中受到抑制，這一觀察結(jié)果與在肥胖小鼠模型中的觀察結(jié)果一致。

為了分析 Epas1 在動脈粥樣硬化中的作用，建立 Epas1EC-KO 和 Epas1EC-WT對照小鼠，暴露于 HFD 以產(chǎn)生高膽固醇血癥（圖3 A）。內(nèi)皮Epas1 缺失對血漿膽固醇水平?jīng)]有影響（圖3 B），然而，小鼠主動脈中的動脈粥樣硬化斑塊明顯更大（圖3 C）。在主動脈根部也測量了斑塊的形成，證實(shí)了與對照組相比，Epas1EC-KO 小鼠存在更大的斑塊（圖3 D）。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮 EPAS1 可防止動脈粥樣硬化。

為了了解內(nèi)皮 EPAS1 的功能，對Epas1EC-KO和對照小鼠的主動脈中進(jìn)行了單細(xì)胞RNAseq，鑒定了 6 個(gè)不同的細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)Epas1 影響 EC 異質(zhì)性。功能注釋顯示，Epas1 調(diào)控的簇富集了多種不同的基因本體術(shù)語，包括細(xì)胞內(nèi)信號通路、轉(zhuǎn)錄/RNA 加工、細(xì)胞增殖和代謝。對Epas1EC-KO和Epas1EC-WT小鼠細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的功能注釋，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)富集的基因本體術(shù)語，包括與肌動蛋白、高爾基體和膜、翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化、線粒體和發(fā)育、MAP 激酶信號傳導(dǎo)和糖蛋白。這些數(shù)據(jù)可有理由假設(shè) EPAS1 可能在動脈內(nèi)皮細(xì)胞其他功能中參與代謝調(diào)節(jié)。

圖3    內(nèi)皮 Epas1 可防止動脈粥樣硬化。

最后，在 LOSS 條件下培養(yǎng)的 PAEC 中敲低EPAS1，研究其調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的潛在作用。據(jù)觀察，EPAS1 沉默導(dǎo)致暴露于 LOSS 的 EC 的基礎(chǔ)耗氧率降低約80%（圖4 A），并且這種耗氧率強(qiáng)烈依賴于脂肪酸β氧化。這些數(shù)據(jù)表明，EPAS1 是脂肪酸β-氧化-依賴性呼吸的正調(diào)節(jié)因子。進(jìn)一步研究 EPAS1 在呼吸中的作用，發(fā)現(xiàn)EPAS1 通過控制脂肪酸β氧化來調(diào)節(jié)呼吸，并且對線粒體活性本身的影響相對較小。

值得注意的是，EPAS1 沉默細(xì)胞中耗氧量的減少可以通過補(bǔ)充外源性 OA 來挽救（圖4 A）。這表明 EPAS1 可能通過控制 EC 產(chǎn)生或處理 FFAs的能力來調(diào)節(jié)脂肪酸 β-氧化途徑的啟動。實(shí)時(shí) PCR 分析顯示，EPAS1 沉默顯著在mRNA 水平上降低內(nèi)皮脂肪酶（LIPG）和分化抗原簇36（CD36）的表達(dá)（圖4 B、C）。

為了確認(rèn) Epas1 對 CD36 和 LIPG 的影響，對小鼠主動脈進(jìn)行了表面染色。WT 小鼠顯示，與 HSS 區(qū)域相比，CD36 和 LIPG 在 LOSS 區(qū)域顯著富集（圖4 D、E）。與對照組相比，Epas1EC-KO中LOSS區(qū)域CD36和LIPG的表達(dá)顯著降低（圖4 D、E），表明Epas1是LOSS區(qū)域這兩種分子富集的必要條件。為了評估 LOSS 區(qū)域 CD36 和 LIPG 的局部富集是否與脂質(zhì)代謝升高相關(guān)，通過口服橄欖油將小鼠暴露于急性高脂血癥，發(fā)現(xiàn)血漿TG水平在90 分鐘后顯著增加。值得注意的是，與 HSS 區(qū)域相比，主動脈弓 LOSS 區(qū)域的脂滴積累增強(qiáng)，表明局部脂質(zhì)攝取增強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)表明，EPAS1 通過正向調(diào)節(jié)協(xié)調(diào) FFA 處理的 CD36 和 LIPG 的表達(dá)，是動脈粥樣硬化 LOSS 區(qū)域內(nèi)皮脂肪酸β-氧化是必需的。

由于 HIF1A 調(diào)節(jié) LOSS 區(qū)域的糖酵解，因此，評估了 EPAS1 對該通路的潛在貢獻(xiàn)。EPAS1 的沉默使糖酵解和糖酵解能力降低。HK2 或 PFKFB3 是受 HIF1A 調(diào)節(jié)的關(guān)鍵糖酵解調(diào)節(jié)劑，免疫印跡顯示，EPAS1 的沉默不會影響其表達(dá)。因此，EPAS1 通過一種不同于 HIF1A 的機(jī)制對糖酵解具有相對適度的影響。

內(nèi)皮脂肪酸-β氧化與DNA 修復(fù)和細(xì)胞增殖密切相關(guān)，因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè) EPAS1 可能是通過脂肪酸代謝來支持內(nèi)皮增殖。與對照組相比，Epas1EC-KO小鼠的EC增殖明顯減少，這表明內(nèi)皮細(xì)胞Epas1是EC增殖所必需的。同樣，對暴露于 LOSS 的 PAEC 的分析表明，EPAS1 沉默后增殖顯著減少。

為了調(diào)和 EPAS1 對脂肪酸β-氧化和增殖的影響，通過用外源性 OA 處理 EPAS1 沉默的 PAEC 來挽救脂肪酸代謝。恢復(fù)代謝顯著增加了 EPAS1 沉默的 PAEC 中 EC 增殖的頻率，表明 EPAS1 通過增強(qiáng)脂肪酸代謝來驅(qū)動增殖。這些數(shù)據(jù)顯示，EPAS1 通過保持 EC 代謝穩(wěn)態(tài)和增殖能力，在血流受到干擾的區(qū)域發(fā)揮動脈粥樣硬化保護(hù)作用。

圖4    內(nèi)皮 EPAS1 通過 LIPG 和 CD36  表達(dá)控制脂肪酸代謝。

圖5   圖形概要

內(nèi)皮細(xì)胞 EPAS1 通過脂肪酸攝取和代謝維持 EC 增殖，從而減輕血流紊亂區(qū)域的動脈粥樣硬化。這種內(nèi)皮修復(fù)途徑在肥胖中受到抑制，表明一種新的甘油三酯-PHD2 調(diào)節(jié)途徑抑制了 EPAS1 表達(dá)。

總之，該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了 EPAS1 在動脈粥樣硬化易感區(qū)域的優(yōu)先表達(dá)，它通過促進(jìn)脂肪酸代謝以支持內(nèi)皮修復(fù)來減緩動脈粥樣硬化。這種保護(hù)性途徑受到肥胖的影響，揭示了一種將系統(tǒng)心血管風(fēng)險(xiǎn)與 EC 功能障礙聯(lián)系起來的新型分子聯(lián)系。這些發(fā)現(xiàn)對有心血管風(fēng)險(xiǎn)的肥胖個(gè)體的臨床管理具有潛在意義。

參考文獻(xiàn)：Pirri D, Tian S, Tardajos-Ayllon B, Irving SE, Donati F, Allen SP, Mammoto T, Vilahur G, Kabir L, Bennett J, Rasool Y, Pericleous C, Mazzei G, McAllan L, Scott WR, Koestler T, Zingg U, Birdsey GM, Miller CL, Schenkel T, Chambers EV, Dunning MJ, Serbanovic-Canic J, Botrè F, Mammoto A, Xu S, Osto E, Han W, Fragiadaki M, Evans PC. EPAS1 Attenuates Atherosclerosis Initiation at Disturbed Flow Sites Through Endothelial Fatty Acid Uptake. Circ Res. 2024 Sep 27;135(8):822-837. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.324054. Epub 2024 Sep 5. PMID: 39234692; PMCID: PMC11424061.

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