Polysciences 24765-1轉染試劑——用于貼壁細胞的轉染流程

操作方法：以 6 孔板轉染 293T 細胞為例
（初次使用 PEI 進行不同基因轉染時應先做預試，優(yōu)化出適合自己實驗的最 佳 PEI 和 DNA 的比例。）

轉染前準備：

1. 轉染前一天:用膠原酶消化細胞并計數(shù)(不建議用胰酶)。按照每孔2x106的細胞量接種 293T至6孔板(每孔加入2ml新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養(yǎng)基和1ml的細胞懸液)置于 37°C，5%C02，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

2. 24h后，移除之前培養(yǎng)基，每孔加入2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。
注意:確保 293T 細胞生長狀態(tài)良好傳代不超過 15 代。

轉染流程：
1. 第一天: 顯微鏡下檢查細胞匯合度，當細胞達到 70%到 80%的匯合度時，開始準備轉染。
2. 對于每孔細胞，用 100μL無血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃度為 1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。

3. 對于每孔細胞，用 100μL無血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEM I培養(yǎng)基)稀釋適當比例的適量24765-1。DNA:PEI的比例要依據(jù)自己實驗摸索最適比例。
4. 將稀釋的 24765-1轉染試劑加入到稀釋的質粒中(總體積 200μL)輕輕混勻，室溫孵育 30 分鐘。

4. 小心地將 PEI-DNA 復合物滴加到細胞培養(yǎng)板每個孔中，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。注意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。
6. 將培養(yǎng)板放入 37°C，5%C02,培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。

觀察結果：
第二天，在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，通常超過 80%的 293T 細胞在轉染后的 24h可以觀察到綠色熒光。

注意：
√ 建議進行不同基因轉染時應對 PEI 和 DNA 的比例進行優(yōu)化，以達到最適比例，通常 篩選范圍在 1:1 到 5:1 之間。

√ 通常情況下，分別準備 PEI 和 DNA 轉染溶液時其體積一般是轉染前每孔細胞培養(yǎng)液 體積總量的 1/10-1/20，如細胞培養(yǎng)液體積為 3ml，則稀釋 PEI 及 DNA 的體積為 150ul 。質粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml（DNA 質量/細胞培養(yǎng)總體積）。

√ 不同質粒種類以及大小會影響轉染效率，如較大片段插入質?？赡苻D染效率低，可根據(jù) 實際實驗需要調整，如適當增加轉染質粒總量等。

√ HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打，但 CHO-S 細胞的粘附性比較強，重懸浮時需要借助細胞刮刀。

√ 一般建議用膠原酶消化細胞，如果表達的是膜蛋白，胰酶消化細胞可能會降低蛋白表達， 建議用膠原酶消化細胞。
√ 對于貼壁性低的細胞系，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。

√ 一旦確定了細胞類型、培養(yǎng)基和 PEI 與 DNA 的最佳比例，就可以在轉染后 24 至 96 小時內多次觀察轉染效率，以優(yōu)化最大表達量時間點。

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