分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--一、酶切連接

一、酶切連接
一般來(lái)說(shuō)，限制性內(nèi)切酶的選擇非常重要。建議從以下方面判斷選擇：
1.限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列在目的載體中存在且只有一個(gè)，在目的片段中不存在；
2.盡量選擇酶切產(chǎn)物為粘性末端、酶切效率高的限制性內(nèi)切酶，如BamH I、Hind III 等；
3.雙酶切時(shí)，注意緩沖液對(duì)兩種內(nèi)切酶的活性影響，可根據(jù)具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間；若緩沖液不能同時(shí)滿足兩種酶的要求，需要分步酶切；
4.單酶切時(shí)，建議對(duì)線性化載體進(jìn)行去磷酸化操作，減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn)。
注： 酶 切 后， 為 防 止 載 體 自 連 ， 尤 其 當(dāng) 酶 切 后 產(chǎn) 物 末 端 可 互 補(bǔ) 或 是 平 端 時(shí) （ 產(chǎn) 物 末 端 的 磷 酸 基團(tuán) 和 羥 基 基 團(tuán) 可 連 接 成 為 酯 鍵 導(dǎo) 致 自 連 發(fā) 生 ）， 有必要進(jìn)行載體的去磷酸化 。在載體去磷酸化過(guò)程中，堿性磷酸酶可去除載體末端的5’磷酸基團(tuán) 。

引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

1.完成目的片段 PCR 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)后，根據(jù)載體線性化使用的限制性內(nèi)切酶，分別在上下游引物的 5’端引入對(duì)應(yīng)內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基；

2.建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的 PCR 擴(kuò)增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。

PCR / 酶切產(chǎn)物的純化回收

PCR/ 酶切反應(yīng)后，產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶；
2.推薦使用切膠回收的方式純化回收 ( 切膠時(shí)間最好控制在 3min 內(nèi)，避免紫外照射對(duì) DNA 的損傷 )，回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測(cè)，并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶；
3.回收濃度低時(shí)，可通過(guò)增加 PCR/ 酶切反應(yīng)體系，采取多管反應(yīng)單管回收的方式，提高回收產(chǎn)物的濃度；
4.PCR 產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)在完成切膠回收操作后，再進(jìn)行酶切反應(yīng)及后續(xù)的純化回收。

目的片段與載體的連接

利用 T4 DNA 連接酶完成酶切后載體與片段的連接重組。
1. 連接體系中使用的線性化載體與目的片段摩爾比可在 1:1 ~ 1:10 之間調(diào)整，一般最適比例為 1:3；
2. 平末端載體與 DNA 片段連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化操作，減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn)；
3. 連接體系各組分投入體積≥ 1μl，濃度過(guò)高時(shí)可稀釋后使用。

感受態(tài)轉(zhuǎn)化涂板
1.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞建議使用克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，不建議使用表達(dá)用感受態(tài)細(xì)胞；
注：DH5α、Fast-T1 適合≤ 15kb 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化；XL10 適合 >10kb 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
2.重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細(xì)胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細(xì)胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細(xì)胞；
3.熱激時(shí)間：按照感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書操作進(jìn)行；
4.平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致；
5.菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g、3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基，保留
100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。

單克隆菌落PCR鑒定

1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落，避免選擇過(guò)大或過(guò)小的單克隆菌落；

2.挑取數(shù)個(gè)單克隆菌落進(jìn)行鑒定分析；
3. 挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后，吸取 1-2μl 作為
PCR 反應(yīng)（10/20μl 體系）模板；
4. 推薦使用一對(duì)分別位于片段和載體的上下游引物進(jìn)行 PCR 鑒定。

常見問(wèn)題分析

未酶切或部分酶切

1. 限制性內(nèi)切酶失活：建議使用新酶；

2. 反應(yīng)體系與程序非最佳化：按照說(shuō)明書建議操作；

3. 限制性內(nèi)切酶濃度過(guò)低：建議增加酶使用量；

4. DNA 模板過(guò)多：按照說(shuō)明書建議操作；

5. 體系存在抑制劑：對(duì)照組操作驗(yàn)證；

6. 識(shí)別位點(diǎn)錯(cuò)誤：測(cè)序驗(yàn)證序列信息；

7. DNA 可能形成超螺旋結(jié)構(gòu)：增加酶量；

8. 識(shí)別位點(diǎn)過(guò)于接近 DNA 末端：末端添加保護(hù)堿基。

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