分子克隆實(shí)驗(yàn)的流程及注意事項(xiàng)--一、酶切連接
一、酶切連接
一般來(lái)說(shuō),限制性內(nèi)切酶的選擇非常重要。建議從以下方面判斷選擇:
1.限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列在目的載體中存在且只有一個(gè),在目的片段中不存在;
2.盡量選擇酶切產(chǎn)物為粘性末端、酶切效率高的限制性內(nèi)切酶,如BamH I、Hind III 等;
3.雙酶切時(shí),注意緩沖液對(duì)兩種內(nèi)切酶的活性影響,可根據(jù)具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時(shí)間;若緩沖液不能同時(shí)滿足兩種酶的要求,需要分步酶切;
4.單酶切時(shí),建議對(duì)線性化載體進(jìn)行去磷酸化操作,減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn)。
注: 酶 切 后, 為 防 止 載 體 自 連 , 尤 其 當(dāng) 酶 切 后 產(chǎn) 物 末 端 可 互 補(bǔ) 或 是 平 端 時(shí) ( 產(chǎn) 物 末 端 的 磷 酸 基團(tuán) 和 羥 基 基 團(tuán) 可 連 接 成 為 酯 鍵 導(dǎo) 致 自 連 發(fā) 生 ), 有必要進(jìn)行載體的去磷酸化 。在載體去磷酸化過(guò)程中,堿性磷酸酶可去除載體末端的5’磷酸基團(tuán) 。
引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增
1.完成目的片段 PCR 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)后,根據(jù)載體線性化使用的限制性內(nèi)切酶,分別在上下游引物的 5’端引入對(duì)應(yīng)內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)與保護(hù)堿基;
2.建議使用高保真酶進(jìn)行目的片段的 PCR 擴(kuò)增,并摸索退火溫度,優(yōu)化反應(yīng)體系和程序。
PCR / 酶切產(chǎn)物的純化回收
PCR/ 酶切反應(yīng)后,產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,判斷是否存在目的大小的條帶;
2.推薦使用切膠回收的方式純化回收 ( 切膠時(shí)間最好控制在 3min 內(nèi),避免紫外照射對(duì) DNA 的損傷 ),回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測(cè),并跑膠鑒定是否僅存在目的條帶;
3.回收濃度低時(shí),可通過(guò)增加 PCR/ 酶切反應(yīng)體系,采取多管反應(yīng)單管回收的方式,提高回收產(chǎn)物的濃度;
4.PCR 產(chǎn)物應(yīng)當(dāng)在完成切膠回收操作后,再進(jìn)行酶切反應(yīng)及后續(xù)的純化回收。
目的片段與載體的連接
利用 T4 DNA 連接酶完成酶切后載體與片段的連接重組。
1. 連接體系中使用的線性化載體與目的片段摩爾比可在 1:1 ~ 1:10 之間調(diào)整,一般最適比例為 1:3;
2. 平末端載體與 DNA 片段連接時(shí),應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化操作,減少載體自身環(huán)化的出現(xiàn);
3. 連接體系各組分投入體積≥ 1μl,濃度過(guò)高時(shí)可稀釋后使用。
感受態(tài)轉(zhuǎn)化涂板
1.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞建議使用克隆用化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,不建議使用表達(dá)用感受態(tài)細(xì)胞;
注:DH5α、Fast-T1 適合≤ 15kb 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化;XL10 適合 >10kb 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
2.重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細(xì)胞體積的比例為 1:10,推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細(xì)胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細(xì)胞;
3.熱激時(shí)間:按照感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書操作進(jìn)行;
4.平板抗生素抗性:平板使用抗性與轉(zhuǎn)化的載體抗性需保持一致;
5.菌液涂板體積:將菌液離心(2500×g、3min),移液槍吸取丟棄多余 LB 培養(yǎng)基,保留
100μl 重懸后全部涂板;或吸取合適體積涂板。
單克隆菌落PCR鑒定
1.挑取平板中體積大小適中的單克隆菌落,避免選擇過(guò)大或過(guò)小的單克隆菌落;
2.挑取數(shù)個(gè)單克隆菌落進(jìn)行鑒定分析;
3. 挑取的菌落放入已添加 10μl ddH2O 的 1.5ml 或 2ml EP 管中溶解混勻后,吸取 1-2μl 作為
PCR 反應(yīng)(10/20μl 體系)模板;
4. 推薦使用一對(duì)分別位于片段和載體的上下游引物進(jìn)行 PCR 鑒定。
常見問(wèn)題分析
未酶切或部分酶切
1. 限制性內(nèi)切酶失活:建議使用新酶;
2. 反應(yīng)體系與程序非最佳化:按照說(shuō)明書建議操作;
3. 限制性內(nèi)切酶濃度過(guò)低:建議增加酶使用量;
4. DNA 模板過(guò)多:按照說(shuō)明書建議操作;
5. 體系存在抑制劑:對(duì)照組操作驗(yàn)證;
6. 識(shí)別位點(diǎn)錯(cuò)誤:測(cè)序驗(yàn)證序列信息;
7. DNA 可能形成超螺旋結(jié)構(gòu):增加酶量;
8. 識(shí)別位點(diǎn)過(guò)于接近 DNA 末端:末端添加保護(hù)堿基。
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