Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理和步驟方案

Cas9（CRISPR相關(guān)蛋白9）是一種由RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶。這種酶與CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相關(guān)，存在于多種細(xì)菌中，包括化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）。Cas9能夠解開外來DNA（如質(zhì)粒DNA或入侵噬菌體DNA），然后檢查是否存在與引導(dǎo)RNA的20個(gè)堿基間隔區(qū)互補(bǔ)的位點(diǎn)。如果DNA底物與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)，Cas9會(huì)切割入侵的DNA。

Cas9蛋白因其作為基因組工程工具而引起全球關(guān)注，它能夠在DNA中引起定點(diǎn)的雙鏈斷裂。由此產(chǎn)生的DNA斷裂可以通過非同源末端連接和同源重組分別失活基因或引入異源基因，這在許多實(shí)驗(yàn)室模型生物中得到了應(yīng)用。此外，Cas9幾乎可以切割與其相關(guān)引導(dǎo)RNA互補(bǔ)的任何序列。在人類細(xì)胞中，已通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因敲除和基因替換。

圖1：CRISPR/Cas9 DNA編輯

艾美捷Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒是一種酶免疫測(cè)定法，用于檢測(cè)和定量細(xì)胞或組織裂解液樣本中的化膿性鏈球菌Cas9。該試劑盒的檢測(cè)靈敏度下限為1.5 ng/mL Cas9。每套試劑盒提供足夠的試劑，可進(jìn)行多達(dá)96次檢測(cè)，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣本。

Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒相關(guān)產(chǎn)品：

1. AKR-120：GFP定量試劑盒，熒光法  

2. AKR-121：GFP ELISA試劑盒  

3. AKR-122：RFP ELISA試劑盒  

4. AKR-130：His標(biāo)簽蛋白ELISA試劑盒  

Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒（#PRB-5079）組成：

盒子1（室溫運(yùn)輸）：

1. 抗Cas9抗體包被板（部件編號(hào)50791B）：一個(gè)96孔條板（8×12）。  

2. 生物素標(biāo)記抗Cas9抗體（1000倍稀釋）（部件編號(hào)50792C）：一個(gè)10 µL小瓶。  

3. 鏈霉親和素-酶偶聯(lián)物（部件編號(hào)310803）：一個(gè)20 µL小瓶。  

4. 檢測(cè)稀釋液（部件編號(hào)310804）：一個(gè)50 mL瓶。  

5. 10倍洗液（部件編號(hào)310806）：一個(gè)100 mL瓶。  

6. 底物溶液（部件編號(hào)310807）：一個(gè)12 mL棕色瓶。  

7. 終止液（部件編號(hào)310808）：一個(gè)12 mL瓶。  

盒子2（藍(lán)色冰袋運(yùn)輸）：

1. Cas9標(biāo)準(zhǔn)品（部件編號(hào)50793D）：一個(gè)50 µL小瓶，含5 µg/mL重組化膿性鏈球菌Cas9。  

未提供材料：

1. 細(xì)胞或組織裂解液  

2. 含0.1% BSA的PBS  

3. RIPA緩沖液  

儲(chǔ)存：

收貨后，將Cas9標(biāo)準(zhǔn)品分裝并儲(chǔ)存于-80°C，以避免多次凍融循環(huán)。將生物素標(biāo)記抗Cas9抗體儲(chǔ)存于-20°C。將其他所有組分儲(chǔ)存于4°C。  

樣本準(zhǔn)備：

以下建議僅供參考，可根據(jù)用戶的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化或調(diào)整。  

- 細(xì)胞或組織裂解液：在裂解緩沖液（如RIPA緩沖液，25 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM NaCl，1% NP-40，1%?；悄懰徕c，0.1% SDS）中超聲處理或勻漿樣本，然后在4°C下以10,000 x g離心10分鐘。立即進(jìn)行檢測(cè)，或在-80°C下儲(chǔ)存樣本，最長可達(dá)三個(gè)月。根據(jù)需要，將樣本稀釋于含0.1% BSA的PBS中。

檢測(cè)步驟：

1. 向抗Cas9抗體包被板中加入100 µL Cas9未知樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)Cas9未知樣本、標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照均需進(jìn)行雙份檢測(cè)。  

2. 在室溫下于軌道振蕩器上孵育1小時(shí)。  

3. 每孔加入250 µL 1倍洗液，洗滌微孔條3次，每次洗滌后c底吸干。最后一次洗滌后，倒空孔內(nèi)液體，并將微孔條在吸水墊或紙巾上輕拍以去除多余的1倍洗液。  

4. 向每孔中加入100 µL稀釋后的生物素標(biāo)記抗Cas9抗體。在室溫下于軌道振蕩器上孵育1小時(shí)。  

5. 按步驟3洗滌條孔3次。  

6. 向每孔中加入100 µL稀釋后的鏈霉親和素-酶偶聯(lián)物。在室溫下于軌道振蕩器上孵育1小時(shí)。  

7. 按步驟3洗滌條孔3次，然后立即進(jìn)行下一步。  

8. 將底物溶液平衡至室溫。向每孔（包括空白孔）中加入100 µL底物溶液，在室溫下于軌道振蕩器上孵育。實(shí)際孵育時(shí)間可能在2-30分鐘之間。  

注意：仔細(xì)觀察平板；如果顏色迅速變化，可能需要提前終止反應(yīng)，以防止飽和。  

9. 向每孔（包括空白孔）中加入100 µL終止液，終止酶反應(yīng)。結(jié)果應(yīng)立即讀取（顏色會(huì)隨時(shí)間消退）。  

10. 使用450 nm作為主波長，在分光光度計(jì)上讀取每個(gè)微孔的吸光度。

Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒文獻(xiàn)參考：

1. Heler, R; Samai, P; Modell, J. W.; Weiner, C; Goldberg, G. W.; Bikard, D; Marraffini, L. A.(2015). Nature. 519 :199–202.

2. Jinek, M.; Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J. A.; Charpentier, E. (2012). Science.337: 816–821.

3. Mali, Prashant; Esvelt, Kevin M; Church, George M (2013). Nature Meth. 10: 957-963.

4. Mali, Prashant; Aach, John; Stranges, P Benjamin; Esvelt, Kevin M; Moosburner, Mark; Kosuri,Sriram; Yang, Luhan; Church, George M (2013). Nature Biotech. 31: 833-838.

5. Gilbert, Luke A.; Larson, Matthew H.; Morsut, Leonardo; Liu, Zairan; Brar, Gloria A.; Torres,Sandra E.; Stern-Ginossar, Noam;Brandman, Onn; Whitehead, Evan H.; Doudna, Jennifer A.;Lim, Wendell A.; Weissman, Jonathan S.; Qi, Lei S. (2013). Cell. 154: 442-451.

6. Zheng Q, Cai X, Tan MH, Schaffert S, Arnold CP, Gong X, Chen C-Z, and Huang S. (2014)BioTechniques 57:115-124.