干貨 | 雙熒光素酶驗(yàn)證miRNA與靶基因3’UTR相互作用！

翌圣雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)服務(wù)流程：

目的細(xì)胞質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)預(yù)實(shí)驗(yàn)

當(dāng)選擇在目的細(xì)胞（而非293 工具細(xì)胞）中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率，以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系，質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時(shí)表明預(yù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)。

轉(zhuǎn)染正式實(shí)驗(yàn)

a. 將狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于24 孔培養(yǎng)板中；

b. 培養(yǎng)過(guò)夜，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；

c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基；

d. 轉(zhuǎn)染取無(wú)菌的1.5 mL EP 管，轉(zhuǎn)染參考轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書(shū)；

e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品。

A 細(xì)胞樣品收集

a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞，輕輕吸凈培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次；

b. 棄去PBS，每孔加入100 μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無(wú)菌水稀釋而得）；

c. 細(xì)胞裂解后，將樣品轉(zhuǎn)移入EP 管中，-80 度冰箱保存。

B 根據(jù)報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)

a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的

EP 管進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay

Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。

c. 熒光素酶檢測(cè)

按照儀器說(shuō)明書(shū)要求將熒光檢測(cè)打開(kāi)，設(shè)定參數(shù)，測(cè)定時(shí)間為10 s，測(cè)定間隔為2 s；

將樣品按照20 μL 的體積加入測(cè)量管中（保持每次樣品的加樣量一致），

另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后

測(cè)定RLU（Relative light unit），同時(shí)設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對(duì)照孔；

將檢測(cè)后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分

混勻后測(cè)定RLU，同時(shí)設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對(duì)照孔。