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熒光定量PCR儀是一種用于分子生物學(xué)檢測的高靈敏度、高特異性的分析儀器。通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記和跟蹤，實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)過程中的熒光信號變化。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程。隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，目標(biāo)DNA的擴(kuò)增會導(dǎo)致熒光信號的增強(qiáng)。通過檢測熒光信號的變化，可以繪制出熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增曲線，從而實(shí)現(xiàn)對靶DNA的定量分析。
熒光定量PCR儀的前期準(zhǔn)備工作：
1、樣品準(zhǔn)備
核酸提?。簭臉颖荆ㄈ缃M織、細(xì)胞、血液等）中提取DNA或RNA。提取過程中要嚴(yán)格按照相應(yīng)的核酸提取試劑盒說明書操作，以確保核酸的純度和完整性。例如，使用柱式提取法時，要注意細(xì)胞裂解的充分性、結(jié)合條件的控制以及洗脫液的用量和溫度等因素。
樣品鑒定與定量：對提取的核酸進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測?？梢允褂梅止夤舛扔?jì)測定核酸的濃度，通過A260/A280比值來判斷核酸的純度（純DNA或RNA的A260/A280比值一般在1.8-2.0之間）。同時，利用瓊脂糖凝膠電泳等方法來鑒定核酸的完整性，確保沒有明顯的降解。
稀釋樣品：根據(jù)熒光定量PCR的檢測范圍和樣品中目標(biāo)核酸的濃度，將樣品稀釋到合適的濃度。如果樣品濃度過高，可能會導(dǎo)致PCR反應(yīng)過早進(jìn)入平臺期，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性；如果樣品濃度過低，則可能無法檢測到足夠的信號。
2、引物和探針設(shè)計(jì)
引物設(shè)計(jì)：根據(jù)目標(biāo)基因的序列信息，設(shè)計(jì)特異性的引物。引物的長度一般在18-25個堿基對之間，GC含量在40%-60%之間。引物的3'端應(yīng)避免連續(xù)的G或C，且不能有互補(bǔ)序列，以防止引物二聚體的形成?？梢允褂脤I(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件（如Primer3、OligoPerfect等）來進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過BLAST等工具驗(yàn)證引物的特異性。
探針設(shè)計(jì)（對于使用探針法的情況）：熒光探針的設(shè)計(jì)要考慮其與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合和熒光標(biāo)記的穩(wěn)定性。探針的長度通常在15-30個堿基之間，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的選擇要根據(jù)儀器的檢測通道來確定。例如，常見的熒光基團(tuán)有FAM（用于檢測綠色熒光）、VIC（用于檢測黃色熒光）等，淬滅基團(tuán)有TAMRA、BHQ等。
3、試劑準(zhǔn)備
PCR反應(yīng)混合液：按照試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)混合液。一般包括緩沖液、dNTPs（三磷酸脫氧核苷）、引物、探針（如果使用）、Taq DNA聚合酶（或其他合適的DNA聚合酶）等。在配制過程中，要注意各種試劑的比例和添加順序，確保混合均勻。
模板添加：將稀釋后的樣品（DNA或RNA）加入到PCR反應(yīng)混合液中。加入的體積要根據(jù)PCR反應(yīng)體系的總體積和樣品濃度來確定，通常每管反應(yīng)體系中加入1-5μL的樣品。
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