熒光檢測PCR定量檢測原理及優(yōu)點

熒光檢測 PCR 定量檢測，即實時熒光定量 PCR（qPCR），其原理是在普通 PCR 的基礎上，加入熒光基團，通過對 PCR 過程中熒光信號的實時監(jiān)測，實現(xiàn)對核酸模板的定量分析，具體如下：

熒光信號產(chǎn)生機制

熒光染料法：常用的熒光染料如 SYBR Green I，它可以特異性地結(jié)合到雙鏈 DNA 的小溝部位。在 PCR 反應體系中，當 DNA 進行復制形成雙鏈時，SYBR Green I 就會結(jié)合到雙鏈 DNA 上，從而被激發(fā)產(chǎn)生熒光信號。而且熒光信號的強度與雙鏈 DNA 的含量成正比關(guān)系。

探針法：使用的是 TaqMan 探針等。TaqMan 探針是一段與目標 DNA 序列特異性互補的寡核苷酸，其 5' 端標記有熒光報告基團（如 FAM），3' 端標記有熒光淬滅基團（如 TAMRA）。在 PCR 反應過程中，當引物延伸到探針結(jié)合部位時，Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性會將探針降解，使得熒光報告基團與淬滅基團分離，從而產(chǎn)生熒光信號。每擴增一條 DNA 鏈，就會有一個探針被切斷，釋放出一個熒光信號。

定量原理

標準曲線法：通過一系列已知濃度的標準品模板進行 PCR 擴增，得到不同濃度標準品對應的熒光信號值，以標準品的起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以對應的熒光閾值循環(huán)數(shù)（Ct 值）為縱坐標，繪制出標準曲線。在相同條件下對未知樣品進行 PCR 擴增，根據(jù)其得到的 Ct 值，從標準曲線上就可以計算出未知樣品的起始拷貝數(shù)。

Ct 值的定義與應用：Ct 值是指在 PCR 擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)。研究表明，在 PCR 反應的指數(shù)增長期，Ct 值與起始模板量的對數(shù)呈線性關(guān)系，即起始模板量越多，Ct 值越??；反之，起始模板量越少，Ct 值越大。因此，可以利用 Ct 值來對模板進行定量分析。

熒光檢測 PCR 定量，即實時熒光定量 PCR（qPCR），具有以下優(yōu)點：

靈敏度高：能夠檢測到極低拷貝數(shù)的核酸模板，可對痕量核酸進行定量分析，比如在病毒感染早期，血液中病毒核酸含量極低時，也能準確檢測出病毒的存在并進行定量，有助于疾病的早期診斷。

特異性強：無論是使用熒光染料法還是探針法，都具有很高的特異性。探針法中，TaqMan 探針與目標 DNA 序列特異性互補結(jié)合，只有當引物和探針都與目標序列準確結(jié)合時才能產(chǎn)生熒光信號，極大地提高了檢測的特異性；熒光染料法中，SYBR Green I 只結(jié)合雙鏈 DNA，且在 PCR 引物設計時會確保其與目標序列特異性結(jié)合，從而保證了檢測的特異性。

精確性好：通過對熒光信號的實時監(jiān)測和對 Ct 值的精確測定，以及標準曲線的建立，能夠?qū)崿F(xiàn)對核酸模板的準確定量。實驗結(jié)果的重復性好，變異系數(shù)通常較低，在科研和臨床診斷等領域能夠提供可靠的數(shù)據(jù)。

快速高效：整個 PCR 過程在封閉的反應體系中進行，無需像傳統(tǒng) PCR 那樣在反應結(jié)束后進行開蓋檢測，減少了操作步驟和時間，同時也降低了污染的風險。一般在 1 - 2 小時內(nèi)就能完成檢測，能夠快速得到檢測結(jié)果，適用于緊急情況和大規(guī)模樣本的檢測。

高通量：可以同時對多個樣本進行檢測，配合自動化的儀器設備，能夠?qū)崿F(xiàn)一次運行檢測幾十甚至上百個樣本，大大提高了檢測效率，適用于大規(guī)模的疾病篩查、基因表達分析等研究和應用。

實時監(jiān)測：在 PCR 擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化，能夠直接觀察到核酸擴增的動態(tài)過程，了解反應的進程和效率，及時發(fā)現(xiàn)異常情況，如引物二聚體的形成、非特異性擴增等，有助于對實驗結(jié)果進行準確的分析和判斷。