干貨 | 雙熒光素酶驗證轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)調(diào)控作用

常用載體：pGL3-Basic 、pGL3-Promoter

圖2 .載體信息

當(dāng)選擇在目的細(xì)胞（而非293 工具細(xì)胞）中進(jìn)行驗證實驗時，首先要確認(rèn)目的細(xì)胞的質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率，以及摸索合適的瞬轉(zhuǎn)體系，質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)效率>40%以上時表明預(yù)實驗通過。

a. 將狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用wanquan培養(yǎng)基懸浮成
單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后，接種于24 孔培養(yǎng)板中；
b. 培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗；
c. 轉(zhuǎn)染2 h 前換液為新鮮的培養(yǎng)基；
d. 轉(zhuǎn)染取無菌的1.5 mL EP 管，按照轉(zhuǎn)染試劑使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染復(fù)合物配置
e. 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞樣品。

a. 轉(zhuǎn)染后從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞，輕輕吸凈培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次；
b. 棄去PBS，每孔加入100μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用無菌水稀釋而得）；
c. 細(xì)胞裂解后，將樣品轉(zhuǎn)移入Ep 管中，-80 度冰箱保存。

• 根據(jù)報告基因檢測試劑盒說明書操作進(jìn)行檢測

a. 將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10,000-15,000 rpm 離心3-5 min。離心后將上清液移入新的EP 管進(jìn)行后續(xù)檢測。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照樣品要求的量，將Renilla Luciferase Assay Reagent(100×)按照稀釋比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混勻后室溫放置。

c. 熒光素酶檢測：

按照儀器說明書要求將熒光檢測打開，設(shè)定參數(shù)，測定時間為10 s，測定間隔為2 s；將樣品按照20 μL 的體積加入測量管中（保持每次樣品的加樣量一致），另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混勻2-3 次（不能漩渦混勻），充分混勻后測定RLU（Relative light unit），同時設(shè)置Cell Lysis buffer 為空白對照孔；將檢測后的樣品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混勻2-3 次，充分混勻后測定RLU，同時設(shè)置Renilla Luciferase Assay 工作液為空白對照孔。

（1）過表達(dá)對照+啟動子對照+海腎內(nèi)參(TK)

（2）過表達(dá)對照+啟動子野生型+海腎內(nèi)參(TK)

（3）過表達(dá)對照+啟動子突變型+海腎內(nèi)參(TK)

（4）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動子對照+海腎內(nèi)參(TK)

（5）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動子野生型+海腎內(nèi)參(TK)

（6）轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)+啟動子突變型+海腎內(nèi)參(TK)