揭秘細胞污染細節(jié)匯集

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之好方法。細胞受到嚴重污染時，有時即使想盡各種辦法也難以挽回。因此，防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵。只有將預(yù)防措施貫穿于整個細胞培養(yǎng)的始終，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。

一、一般預(yù)防細胞污染以下幾方面：

1、從物品、用品消毒滅菌著手

細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹di，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在取樣檢菌一周后確認無菌才能使用。同時，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇最后過濾的液體進行檢測。定期對二氧化碳培養(yǎng)箱進行消毒。具體操作：75%的酒精搽拭培養(yǎng)箱后，使用可移動的紫外燈至少消毒 30min，加入高壓滅菌過的超純水于培養(yǎng)箱水槽中保持濕度。也可配制300ml的飽和硫酸銅加3L滅菌超純水混合成硫酸銅溶液加入水槽中。

2、添加抗生素

各種抗生素性質(zhì)不同，對各種微生物的作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好。但反復使用抗生素會使微生物產(chǎn)生耐藥性，且對細胞本身也有一定影響，因此為避免誘導抗藥細菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)中的抗生素，或盡可能不用抗生素處理。

3、從操作者做起

（1）進無菌室前要徹di洗手，按規(guī)定穿隔離衣。開始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

（2）操作者動作要輕，安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時間燒灼，以防退火；燒過的器械要冷卻后才能使用；已吸過培養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內(nèi)的培養(yǎng)液成分如蛋白質(zhì)等燒焦后會產(chǎn)生有害物質(zhì)，吸管再用時會將其帶到培養(yǎng)液中；膠塞、橡皮乳頭及塑料的細胞培養(yǎng)用品過火焰是也不能時間太長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害培養(yǎng)細胞，同時塑料細胞培養(yǎng)用品也會產(chǎn)生變形影響使用。

（3）操作時盡量不要談話，咳嗽以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。

（4）使用培養(yǎng)液前不宜過早開瓶，開瓶后的培養(yǎng)液應(yīng)保持斜位，避免直立，以防止下落細菌的污染。不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封閉瓶口，培養(yǎng)的細胞在處理之前勿過早暴露在空氣中。

（5）操作完畢后應(yīng)整理好工作臺面，用消毒水浸泡的紗布擦拭臺面。

（6） 吸取培養(yǎng)液、細胞懸液時，應(yīng)專管專用，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去，以防止污染擴大或造成培養(yǎng)物之間的交叉污染。

4、防止細胞交叉污染

所有從別處轉(zhuǎn)來的或是自己所建的細胞系都要早期留有的充足的凍存儲備，一旦懷疑發(fā)生交叉污染，可做細胞遺傳學方面的鑒定，如發(fā)現(xiàn)原有的細胞遺傳物發(fā)生改變，可以復蘇早期凍存的細胞使用。重要細胞系（株）的傳代工作應(yīng)由兩人獨立進行。

5、無菌室的徹di消毒

（1） 新潔爾滅全面徹di擦洗無菌室。使用前應(yīng)稀釋即配即用。新潔爾滅和酒精相比，最大的優(yōu)點是便宜，因為新潔爾滅500ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價格可能是新潔爾滅的幾十倍。

（2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣體對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。甲醛價廉，熏蒸消毒時不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含37-40%的甲醛。

二、預(yù)防細胞污染主要用法：

1、熏蒸消毒：每立方米空間甲醛用量為10~15毫升，熏蒸消毒時應(yīng)密閉門窗封閉至少4h以上。高錳酸鉀加40%甲醛（1:1）混合后放入一開發(fā)容器中，立即可見白色甲醛煙霧。消毒后可放入25%氨水蒸發(fā)中和刺激氣味。氨水用量為所用甲醛水溶液的一半，時間為30分鐘。甲醛氣體毒性非常強，所以操作時一定需帶上防毒面具。

2、自然揮發(fā)： 將較大量的甲醛水溶液放入一敞開容器中，室內(nèi)溫度保持在18攝氏度以上，同時室內(nèi)噴水以保持相對濕度在70%以上，經(jīng)16小時可達到室內(nèi)消毒的目的。

三、細胞發(fā)生污染處理方法：

首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。

下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟：

1、在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

2、分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下 列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3、每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

4、確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代。

5、在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。

6、重復步驟4。

7、在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。