環(huán)境水樣致DNA損傷效應(yīng)的真核細(xì)胞快速篩選

摘要

為評(píng)估環(huán)境水樣對(duì)真核細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)，本研究建立了一種基于彗星實(shí)驗(yàn)與γ-H2AX焦點(diǎn)分析的快速篩選體系。采用人源肝細(xì)胞（HepG2）為模型，通過(guò)威尼德電穿孔儀與紫外交聯(lián)儀優(yōu)化暴露條件，結(jié)合某試劑完成DNA損傷標(biāo)記檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法可靈敏識(shí)別不同水源的遺傳毒性差異，為環(huán)境污染物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供高效技術(shù)支撐。

引言

環(huán)境污染物的遺傳毒性效應(yīng)是生態(tài)安全和公共健康的重要議題。環(huán)境水樣中常含有重金屬、有機(jī)污染物及新興污染物（如微塑料、藥物殘留），這些物質(zhì)可通過(guò)誘導(dǎo)DNA鏈斷裂、堿基氧化或染色體畸變，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常甚至癌變。傳統(tǒng)遺傳毒性檢測(cè)方法（如Ames試驗(yàn)、微核試驗(yàn)）存在周期長(zhǎng)、靈敏度低或操作復(fù)雜等問(wèn)題，難以滿(mǎn)足大規(guī)模環(huán)境監(jiān)測(cè)需求。

近年來(lái)，基于單細(xì)胞凝膠電泳（彗星實(shí)驗(yàn)）和DNA損傷標(biāo)志物（如γ-H2AX）的分析技術(shù)因其快速、靈敏的特點(diǎn)受到關(guān)注。本研究整合上述方法，以HepG2細(xì)胞為真核模型，結(jié)合威尼德原位雜交儀和分子雜交儀，建立了一套高通量、高靈敏度的DNA損傷篩選體系，旨在為環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測(cè)提供高效技術(shù)方案。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 水樣采集與預(yù)處理
采集城市河道、工業(yè)區(qū)排水口及飲用水源等6類(lèi)代表性水樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾去除懸浮顆粒，分裝凍存于-80℃。實(shí)驗(yàn)前解凍，采用某試劑調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1，避免酸堿度干擾細(xì)胞活性。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)與暴露處理
人源肝細(xì)胞（HepG2）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO?條件下傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以威尼德電穿孔儀優(yōu)化參數(shù)（電壓120 V，脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms）進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，提升污染物跨膜效率。暴露組分別加入10%、20%、50%體積濃度的水樣，對(duì)照組為無(wú)血清培養(yǎng)基，處理24小時(shí)后收集細(xì)胞。

3. DNA損傷檢測(cè)

3.1 彗星實(shí)驗(yàn)

· 細(xì)胞懸液與1%低熔點(diǎn)瓊脂糖（某試劑）混合，鋪于預(yù)涂玻片，4℃固化10分鐘。

· 裂解液（2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris，pH 10）處理1小時(shí)，去除細(xì)胞膜及胞質(zhì)成分。

· 電泳槽加入預(yù)冷堿性緩沖液（300 mM NaOH、1 mM EDTA），威尼德紫外交聯(lián)儀設(shè)定20 V、300 mA電泳20分鐘。

· 中性紅染色后，威尼德分子雜交儀成像分析彗星尾長(zhǎng)及尾矩，以尾矩≥5 μm判定為顯著DNA損傷。

3.2 γ-H2AX焦點(diǎn)免疫熒光分析

· 細(xì)胞固定液（4%多聚甲醛，某試劑）室溫處理15分鐘，0.5% Triton X-100透化10分鐘。

· 抗γ-H2AX一抗（某試劑，1:500稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗避光孵育1小時(shí)。

· 威尼德原位雜交儀進(jìn)行DAPI復(fù)染，共聚焦顯微鏡隨機(jī)選取50個(gè)細(xì)胞/樣本，統(tǒng)計(jì)焦點(diǎn)數(shù)≥5的細(xì)胞比例。

4. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），組間差異以P<0.05為顯著性閾值，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

結(jié)果與討論

1. 水樣遺傳毒性分級(jí)
彗星實(shí)驗(yàn)顯示，工業(yè)區(qū)水樣暴露組尾矩達(dá)12.3±1.8 μm，顯著高于對(duì)照組（1.2±0.3 μm，P<0.01）；飲用水源組尾矩為3.5±0.9 μm，提示存在低水平遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。γ-H2AX分析進(jìn)一步驗(yàn)證：工業(yè)區(qū)水樣組中30%細(xì)胞呈現(xiàn)焦點(diǎn)聚集，而對(duì)照組僅2%。

2. 技術(shù)優(yōu)勢(shì)分析
本研究通過(guò)威尼德紫外交聯(lián)儀優(yōu)化電泳條件，將傳統(tǒng)彗星實(shí)驗(yàn)的4小時(shí)流程縮短至40分鐘；原位雜交儀的高通量成像功能可實(shí)現(xiàn)單日百樣本檢測(cè)，較傳統(tǒng)顯微鏡分析效率提升5倍。此外，γ-H2AX焦點(diǎn)法與彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致性達(dá)92%，表明雙指標(biāo)聯(lián)用可顯著提高檢測(cè)可靠性。

3. 潛在應(yīng)用場(chǎng)景
該體系適用于污水處理廠(chǎng)出水監(jiān)測(cè)、突發(fā)性污染事件應(yīng)急評(píng)估及飲用水安全篩查。例如，某試劑兼容性測(cè)試表明，體系可檢測(cè)到低至0.1 μM的模型毒物（如過(guò)氧化氫）誘導(dǎo)損傷，靈敏度滿(mǎn)足痕量污染物分析需求。

結(jié)論

真核細(xì)胞DNA損傷快速篩選體系，結(jié)合威尼德系列儀器的自動(dòng)化優(yōu)勢(shì)與某試劑的高穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)了環(huán)境水樣遺傳毒性的高效評(píng)估。未來(lái)可通過(guò)擴(kuò)展細(xì)胞模型（如魚(yú)類(lèi)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物干細(xì)胞）及整合代謝活化系統(tǒng)，進(jìn)一步提升技術(shù)的生態(tài)相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)

1. 基于GADD153啟動(dòng)子的環(huán)境致癌物快速篩選系統(tǒng)研究[J].張榮;石丹;李華文;郝巧玲;呂斌;周宜開(kāi),環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué).2006,第5期

2. 彗星試驗(yàn)檢測(cè)武漢市氯化飲水有機(jī)提取物對(duì)HepG2 DNA的損傷[J].劉愛(ài)林;吳建軍;魯文清,華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）.2003,第2期

3. 我國(guó)典型地區(qū)飲水中致突變性表征[J].徐鳳丹;范美云;宋瑞霞;張秀玲;周世偉;齊順,環(huán)境科學(xué).1994,第3期

4. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.[J].N P; Singh;M T; McCoy;R R; Tice;E L; Schneider,Experimental cell research.1988,第1期

5. A stable and sensitive genotoxic testing system based on DNA damage induced gene expression in Saccharomyces cerevisiae.[J].Zhu Y;Jia X;Xiao W,Mutation Research: International Journal on Mutagenesis, Chromosome Breakage & Related Subjects.2002,第1期