內(nèi)標法還是外標法，清楚訣竅后選擇并不難！

百歐博偉生物：內(nèi)標法和外標法都是常用的定量分析方法，在不同的分析條件下，面對不同的要求，再加上分析成本和效率等因素的考慮，靈活選用簡單而有效的定量方法很重要。那么，如何選用內(nèi)標法或外標法？它們各有什么優(yōu)缺點？本期我們特整理了相關內(nèi)容，希望對大家有所幫助！

一、外標法定義及優(yōu)缺點

1、什么是外標法？

用待測組分的已知濃度的標準溶液（作為對照物）繪制校準曲線，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量的方法，稱為外標法。

具體做法是：用待測組分的標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與待測組分相同的色譜條件下，等體積準確量進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線，此標準工作曲線應是通過原點的直線。

若標準工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統(tǒng)誤差。標準工作曲線的斜率即為校正因子。

2、外標法優(yōu)缺點

優(yōu)點：

（1）操作、計算簡單；

（2）無需各組分都被檢出、洗脫；

（3）適用于大量樣品的分析。

缺點：

（1）實驗條件要求高，標樣及未知樣品的測定條件要一致，如：檢測器的靈敏度，流速、流動相組成不能發(fā)生變化；

（2）進樣體積要準確，每次進樣體積要有好的重復性。

二、內(nèi)標法定義及優(yōu)缺點

1、什么是內(nèi)標法？

內(nèi)標法是一種間接的校準方法，是在建立校準曲線時，每個校準序列里加入相同量的物質(zhì)作為內(nèi)標物，根據(jù)被測試樣和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。

具體做法是：在樣品中加入一定量的標準物質(zhì)，它可被色譜柱所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。

2、內(nèi)標法的優(yōu)缺點

一般用外標法來定量，如果進樣體積很難掌握，就用內(nèi)標法，可以消除進樣體積的誤差。那內(nèi)標法有哪些優(yōu)點和缺點，一起看一下：

優(yōu)點：

進樣量的變化、色譜條件的微小變化，對內(nèi)標法定量結(jié)果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取、衍生化等）前加入內(nèi)標物，然后再進行前處理時，可部分補償欲測組分在樣品前處理時的損失。若要獲得很高精度的結(jié)果時，可以加入數(shù)種內(nèi)標物，以提高定量分析的精度。

缺點：

（1）內(nèi)標法必須每個樣品中都加入內(nèi)標物，增加了工作量也增加了成本；

（2）在進行多組分分析時，必須保證內(nèi)標物有足夠的分離度，加大了方法建立難度；

（3）作為內(nèi)標物的要求較高，并不容易選擇。

3、內(nèi)標物的選擇原則

對于內(nèi)標法定量分析來說，內(nèi)標物的選擇是極其重要的。內(nèi)標物必須滿足如下的條件：

（1）內(nèi)標物必須是試樣中不存在的物質(zhì)；

（2）應當是純凈的己知化合物，且內(nèi)標物和被測組分要有基本相同或盡可能一致的物理化學性質(zhì)(如：沸點、極性、化學結(jié)構(gòu)等)、色譜行為和響應特征；

（3）必須溶于被測樣品(或溶劑)中，且不與被測樣品起化學反應并與試樣中各組分的色譜峰能分離；

（4）加入的內(nèi)標物的量應接近于被測組分；

（5）色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近或在幾個被測組分色譜峰中間。且又不共溢出，目的是為了避免儀器的不穩(wěn)定性所造成的靈敏度的差異；

（6）選擇合適的內(nèi)標物加入量，使得內(nèi)標物和被分析物質(zhì)二者峰面積的匹配性大于75%，以免由于它們處在不同響應值區(qū)域而導致的靈敏度偏差。

三、選用案例解析

其實，內(nèi)標法與外標法都是定量的一種方法，至于哪一種方法好與不好，不能一概而論，還是要不同情況不同分析，我們摘取了幾個網(wǎng)友的案例，方便大家理解：

案例1

“以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差。

其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，首先我們應確認實驗室儀器和條件是否調(diào)整到了一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)。

比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化），汽化溫度是否合適，色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配），附近有沒有其它色譜峰的干擾，選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）。

如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是適用的。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中，有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內(nèi)標與外標都有（用的都是自動進樣），精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求。

當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標外標，都是可行的。當然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。

而有些時候，可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設備的影響，達不到一定的要求，還必須進行定量分析，有時外標的結(jié)果可能就要差一些。這時，你可能就要考慮用內(nèi)標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。”

案例2

“ 對于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的要求，對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松得多，RSD有時可以允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應用空間?！?/span>

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