丙酮酸測(cè)定試劑盒--簡(jiǎn)單敏感的方法，適用于各種生物樣本類型

丙酮酸是細(xì)胞代謝中的關(guān)鍵分子。它是糖酵解的最終產(chǎn)物，也是需氧和厭氧呼吸的初始步驟。在需氧條件下，丙酮酸進(jìn)入線粒體，在那里它經(jīng)歷進(jìn)一步的氧化，通過(guò)克雷布斯循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生能量豐富的分子，如ATP?；蛘撸趨捬鯒l件下，丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為乳酸，再生糖酵解繼續(xù)所需的輔因子NAD+。丙酮酸還作為各種生物合成途徑的關(guān)鍵前體，包括氨基酸和脂肪酸的合成。它在能量生產(chǎn)和生物合成中的核心作用使丙酮酸成為細(xì)胞過(guò)程中的基本分子。AkrivisBio丙酮酸檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單敏感的方法，用于定量從低于1μM到10mM范圍內(nèi)的丙酮酸，適用于各種生物樣本類型。

艾美捷丙酮酸測(cè)定試劑盒：

貨號(hào)：MA-0129

孔數(shù)：100孔

樣本類型：組織提取物、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、尿液、其他生物液體

物種：所有物種

檢測(cè)方法：比色法，OD 570納米或熒光法，激發(fā)/發(fā)射 = 535/580納米

檢測(cè)類型：定量

應(yīng)用：一種基于板的比色法/熒光法檢測(cè)，用于在1 μM - 10 mM范圍內(nèi)定量各種生物樣本中的丙酮酸。

靈敏度：1 uM-10 mM

儲(chǔ)存條件：-20°C

運(yùn)輸溫度：使用冰袋

丙酮酸測(cè)定試劑盒組分：

-檢測(cè)緩沖液25毫升WMMA-0129-A

-ADHP溶液200微升紅色MA-0129-B

-丙酮酸氧化酶/過(guò)氧化氫酶凍干綠色MA-0129-C

-丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品100微升黃色MA-0129-D

儲(chǔ)存和處理：將所有組件儲(chǔ)存在-20°C。使用前將其升至室溫。打開前短暫離心小瓶。

-檢測(cè)緩沖液：使用前升至室溫。儲(chǔ)存在4°C。

-ADHP溶液：升至室溫以融化DMSO溶液?；旌暇鶆?，儲(chǔ)存在-20°C。

-丙酮酸氧化酶/過(guò)氧化氫酶：加入220微升檢測(cè)緩沖液溶解。儲(chǔ)存在-20°C。

檢測(cè)方案：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線：

a.基于吸光度的檢測(cè)（樣本中約100μM–10mM）：通過(guò)將10微升標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到990微升檢測(cè)緩沖液中，將丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.4mM。

b.基于熒光的檢測(cè)（約0.2μM–100μM）：通過(guò)向990微升檢測(cè)緩沖液中添加10微升標(biāo)準(zhǔn)品，然后將10微升轉(zhuǎn)移到90微升檢測(cè)緩沖液中，進(jìn)一步稀釋丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品至最終濃度0.04mM。

c.混合均勻。將0–5–10–15–20–25微升加入96孔板中的一系列孔中。通過(guò)添加檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升，為比色法檢測(cè)提供0,2,4,6,8,10納摩爾/孔的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品。（熒光法檢測(cè)為0,200,400,600,800,1000皮摩爾/孔）。

2.樣本準(zhǔn)備：用50微升檢測(cè)緩沖液勻漿組織（10毫克）或細(xì)胞（10^6）。以16,000Xg離心5分鐘，然后將5-50微升清澈上清液加入96孔板中的孔中。將唾液以16,000Xg離心5分鐘，然后加入10微升到孔中?？梢灾苯酉驑颖究字屑尤胙澹?span style="font-family: Calibri;">10微升）。用檢測(cè)緩沖液將所有孔的體積調(diào)整至50微升。

注意：

a.血清中的LDH活性可以將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。血清樣本應(yīng)儲(chǔ)存在-80°C。解凍后立即使用。

b.使用10kDa旋轉(zhuǎn)柱對(duì)樣本進(jìn)行去蛋白處理，以去除可能消耗丙酮酸的酶。

c.一些樣本背景較高。因此，以雙份運(yùn)行樣本，并使用配對(duì)孔確定背景。

d.在極少數(shù)情況下，內(nèi)源性化合物可能干擾酶反應(yīng)。使用配對(duì)樣本，向其中一個(gè)測(cè)試樣本中添加內(nèi)標(biāo)（吸光度2-5納摩爾，熒光100皮摩爾），以準(zhǔn)確測(cè)量丙酮酸（下面解釋的程序）。

3.啟動(dòng)反應(yīng)：為要運(yùn)行的總孔數(shù)準(zhǔn)備足夠的反應(yīng)混合物。每個(gè)孔需要50微升含有以下成分的反應(yīng)混合物：

1）反應(yīng)混合物：

樣本/標(biāo)準(zhǔn)孔混合

背景對(duì)照混合

檢測(cè)緩沖液46微升（使用熒光時(shí)47.6微升）

ADHP溶液2微升（使用熒光時(shí)0.4微升）

丙酮酸氧化酶/過(guò)氧化氫酶2微升

2）向每個(gè)含有丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣本的孔中加入50微升反應(yīng)混合物。向背景孔中加入50微升背景對(duì)照混合。

4.測(cè)量：使用微孔板讀取器在室溫下通過(guò)吸光度（570納米）或熒光（激發(fā)/發(fā)射=535/590納米）監(jiān)測(cè)反應(yīng)30分鐘。

5.典型結(jié)果：

6.計(jì)算：從所有標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)中減去0標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)。繪制丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。該值將用于計(jì)算未知測(cè)試樣本中的丙酮酸。如果運(yùn)行了背景對(duì)照孔，則從每個(gè)配對(duì)未知樣本中減去背景讀數(shù)。將背景校正后的樣本信號(hào)除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。這給出了孔中的納摩爾或皮摩爾丙酮酸。

對(duì)于添加了內(nèi)標(biāo)的樣本，從未知樣本中減去添加了已知量丙酮酸的未知樣本。獲得的信號(hào)是系統(tǒng)對(duì)添加量的響應(yīng)。僅含有未知物的孔中丙酮酸的校正量={未知樣本信號(hào)/[（添加樣本信號(hào)-未知樣本信號(hào)）/添加量]}

要將孔中的量轉(zhuǎn)換為原始樣本中的丙酮酸量：

A.孔中的丙酮酸納摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=每微升樣本的丙酮酸納摩爾數(shù)。

B.每微升樣本的丙酮酸納摩爾數(shù)X樣本總體積（原始樣本+稀釋液體積）=樣本中的總丙酮酸納摩爾數(shù)

C.樣本中的總丙酮酸納摩爾數(shù)/組織毫克數(shù)（或細(xì)胞數(shù)或血清微升數(shù)等）=每毫克組織（細(xì)胞等）的丙酮酸納摩爾數(shù)。