從原理到實(shí)操，蝦青素抗肝纖維化實(shí)驗(yàn)流程?。?）

2 DMN（二甲基亞硝胺）誘導(dǎo)C57小鼠肝纖維化模型建立

2.1 原理  

二甲基亞硝胺（DMN）通過肝臟代謝生成甲基自由基，直接損傷肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，激活炎癥反應(yīng)（TNF-α、IL-6釋放）和肝星狀細(xì)胞（HSC）活化，促進(jìn)膠原蛋白（Ⅰ/Ⅲ型）異常沉積，最終形成肝纖維化。其機(jī)制不依賴致癌性基因突變，而通過氧化應(yīng)激與ECM代謝失衡驅(qū)動(dòng)纖維化進(jìn)程。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟  

2.2.1 動(dòng)物準(zhǔn)備

• 品系選擇：雄性C57BL/6J小鼠（6-8周齡），雄性對(duì)DMN肝毒性更敏感。

• 環(huán)境適應(yīng)：SPF級(jí)環(huán)境中適應(yīng)1周，自由攝食飲水，維持12小時(shí)光/暗周期。

2.2.2 DMN給藥方案

纖維化誘導(dǎo)方案：

• 劑量：DMN 1mg/ml（溶于生理鹽水，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配）。  

• 注射方式：每日固定時(shí)間1次腹腔注射，每周隔天注射共3天，隨后停藥4天（每周為1個(gè)循環(huán)）。  

• 總周期：4周（共12次注射）。  

關(guān)鍵注意：

• 注射時(shí)避免漏液（易致腹膜炎癥）。

• 每周監(jiān)測(cè)體重，存活率需＞80%（劑量過高易致死）。  

2.2.3 實(shí)驗(yàn)周期

• 急性損傷期：注射后1-2周，肝細(xì)胞壞死與炎癥浸潤(rùn)顯著。

• 纖維化形成期：注射后3-4周，門靜脈周圍膠原沉積，橋接纖維間隔形成。

2.3 模型驗(yàn)證方法  

2.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè)

• 血清肝功能：ALT、AST水平升高2-3倍（ELISA法）。

• 肝纖維化標(biāo)志物：羥脯氨酸（Hyp）含量增加＞50%（比色法）。

2.3.2 病理學(xué)分析

1. 大體觀察：肝臟表面粗糙，可見灰白色纖維條索（圖1）。

2. 組織切片：

• H&E染色：肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維間隔形成。

• 天狼星紅染色：膠原沉積面積定量（紅色區(qū)域占比≥15%）。

• 免疫組化：α-SMA（活化的HSC標(biāo)志物）陽(yáng)性率＞30%。

2.3.3 分子標(biāo)志物檢測(cè)

• Western blot：TGF-β、CollagenⅠ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。

• qPCR：MMP-2/9下調(diào)，TIMP-1上調(diào)，提示ECM降解受阻。

總結(jié)

DMN通過氧化損傷→炎癥→HSC活化→膠原沉積的級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)肝纖維化，模型穩(wěn)定且重復(fù)性高，需結(jié)合多維度指標(biāo)（生化、病理、分子）驗(yàn)證，適用于抗纖維化機(jī)制與藥物研究

2.4 關(guān)鍵注意事項(xiàng)

2.4.1 劑量控制

DMN劑量>15 mg/kg可能導(dǎo)致急性肝壞死（圖二），<5 mg/kg則肝損傷發(fā)生率低。

2.4.2 品系與性別差異

• C57BL/6J小鼠對(duì)DMN敏感性低于其他品系（如B6C3F1），需延長(zhǎng)誘導(dǎo)周期。  

• 雌性小鼠因雌激素保護(hù)作用，肝纖維化發(fā)生率顯著低于雄性。  

2.4.3 倫理與動(dòng)物福利

• 每周監(jiān)測(cè)體重、活動(dòng)度及毛發(fā)狀態(tài)。  

• 肝損傷體積>2000 mm3或體重下降≥20%時(shí)，使其優(yōu)逝。

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