Hes1/Piezo1 通路在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥病理生理機(jī)制中的關(guān)鍵作用

The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis

Keywords: Bone biology; Bone disease; Osteoporosis; Therapeutics.

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥（GIOP）是在接受糖皮質(zhì)激素治療的自身免疫性疾病患者中觀察到的主要副作用。GIOP 患者的骨折風(fēng)險與骨密度（BMD）的相關(guān)性低于傳統(tǒng)骨質(zhì)疏松癥患者，這表明糖皮質(zhì)激素對骨質(zhì)量和骨量有負(fù)面影響。重要的是，機(jī)械應(yīng)力鍛煉已被證明可以增強(qiáng) GIOP 中的 BMD。雖然單獨(dú)使用阿侖膦酸鈉是不夠的，但它與機(jī)械應(yīng)力的結(jié)合會顯著提高 BMD。這些發(fā)現(xiàn)表明，模擬骨細(xì)胞機(jī)械應(yīng)力的治療可能是 GIOP 藥物開發(fā)的突破。

目前，使用條件性骨細(xì)胞特異性 Piezo1 敲除小鼠的研究表明，Piezo1 的缺失會導(dǎo)致皮質(zhì)骨參數(shù)受損，這突出了 Piezo1 在通過鈣內(nèi)流和上調(diào) Wnt 通路介導(dǎo)機(jī)械誘導(dǎo)骨形成中的重要性。Yoda1 是一種 Piezo1 激動劑，已被證明可以增加完整嚙齒動物的 BMD 并縮短小鼠骨折的愈合時間。然而，Piezo1 激活對疾病進(jìn)展期間 GIOP 小鼠模型中機(jī)械應(yīng)力的影響尚未見報道。

最近，大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院肌肉骨骼再生醫(yī)學(xué)系、骨科生物材料科學(xué)系及運(yùn)動醫(yī)學(xué)生物力學(xué)系課題組的一項研究旨在闡明機(jī)械敏感受體 Piezo1 在 GIOP 發(fā)病機(jī)制中的作用和機(jī)制，并探討了 Piezo1 通路的激活是否可以改善 GIOP 的狀況。研究結(jié)果表明，骨細(xì)胞和骨膜細(xì)胞中 Piezo1 表達(dá)和活性的降低有助于 GIOP，而Yoda1 可能通過恢復(fù)機(jī)械敏感性提供來一種新的治療方法。研究成果發(fā)表于 JCI Insight  期刊題為“The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis”。

首先，實驗研究了 GIOP 和非 GIOP 骨組織之間的病理生理差異，發(fā)現(xiàn)與非 GIOP 患者相比，GIOP 患者組織中空腔隙的比例明顯更高。值得注意的是，GIOP患者骨細(xì)胞中Piezo1表達(dá)下調(diào)，且在 GIOP 組中觀察到 TUNEL 陽性骨細(xì)胞的顯著增加。

然后，在 GIOP 模型中研究了 Yoda1 的作用。對小鼠同時給予地塞米松（DEX）和 Yoda1 處理，發(fā)現(xiàn)與對照處理組相比，DEX 處理組的骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、小梁數(shù)（Tb. N.）和皮質(zhì)厚度（Ct. Th.）顯著降低，但用 DEX 和 Yoda1 聯(lián)合治療后，這些影響幾乎緩解。此外，皮質(zhì)骨孔隙率（Po. tot 和 Po.V）和與骨小梁結(jié)構(gòu)相關(guān)的參數(shù)在 DEX 組中顯著加劇，但因 Yoda1 而減弱。骨組織形態(tài)學(xué)分析顯示，DEX 組成骨細(xì)胞表面（Ob. S/OS）、類骨質(zhì)體積（OV/OS）、皮質(zhì)骨寬度（Ct. Wi.）和皮質(zhì)骨面積（Ct. Ar.）顯著降低，但Yoda1 有效防止了這些影響。在進(jìn)一步研究潛在機(jī)制時，分析顯示在 DEX 處理組，骨細(xì)胞中的 Piezo1 表達(dá)顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，Yoda1 可防止 GIOP 小鼠模型股骨的結(jié)構(gòu)變化和脆弱性。

在體內(nèi)，對小鼠進(jìn)行軸向脛骨負(fù)荷（13N）以直接評估在 GIOP 背景下受損的機(jī)械應(yīng)力響應(yīng)（圖1 A）。然而，與對照處理組相比，DEX 處理組對機(jī)械負(fù)荷沒有反應(yīng)。相比之下，同時接受 DEX 和 Yoda1 給藥的組在負(fù)荷干預(yù)后表現(xiàn)出 BV/TV、Tb. N 和 Ct. Th. 的顯著增強(qiáng)，類似于對照處理組（圖1 B、C）。此外，機(jī)械負(fù)荷顯著降低了對照組和 DEX 和 Yoda1 聯(lián)合處理組 Po. tot 水平，增加了礦物質(zhì)附著率（MAR）、骨形成率（BFR）、骨鈣素-陽性骨膜細(xì)胞水平，而 DEX 處理組未發(fā)現(xiàn)這種負(fù)荷響應(yīng)（圖1 C-H）。相比之下，無論機(jī)械負(fù)荷如何，DEX 處理組骨小梁表面的 TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)量都顯著增加，而在對照或 DEX 和 Yoda1 聯(lián)合處理組中未觀察到這一點(diǎn)（圖1 I、J）。這些數(shù)據(jù)表明，Yoda1 減弱了糖皮質(zhì)激素引起的機(jī)械應(yīng)力的衰減反應(yīng)。

圖1    Yoda1 逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的機(jī)械驅(qū)動骨反應(yīng)的衰減。

在檢查了一系列表明骨細(xì)胞有顯著影響的體內(nèi)數(shù)據(jù)后，接下來進(jìn)行了人皮質(zhì)骨器官培養(yǎng)測定，以闡明基因表達(dá)對骨代謝關(guān)鍵作用的影響（圖2 A-D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PIEZO1 和 PTGS2 表達(dá)水平被 DEX 處理抑制，而 Yoda1 保留了與對照相當(dāng)?shù)幕虮磉_(dá)水平（圖2 A ）。相反，DEX 處理后 SOST 和 RANKL/OPG 比率上調(diào)，但在 Yoda1 處理后保持在對照水平（圖2 B、D）。此外，在DEX 和 Yoda1 處理下，WNT16 表達(dá)增加（圖2 C）。在蛋白質(zhì)水平上，MLO-Y4 細(xì)胞系中的 Piezo1 表達(dá)被 DEX 降低，但 Yoda1 處理可使其得到劑量反應(yīng)性恢復(fù)（圖2 E）。此外，研究了 Piezo1 中的下游磷酸化信號通路，發(fā)現(xiàn) Yoda1 處理上調(diào)了 Akt 和 ERK 磷酸化，而這被 DEX 處理下調(diào)，且Yoda1 可以促進(jìn)被 DEX 抑制的 Akt 和 ERK 磷酸化（圖2 F、G）。

定量評估 MLO-Y4 細(xì)胞中的鈣內(nèi)流，發(fā)現(xiàn) Yoda1 可顯著加速 Ca2+ 內(nèi)流，但與 3 μM DEX 預(yù)孵育減弱了這種影響。相比之下，與 1 μM DEX 和更高濃度的 Yoda1（10 μM）共處理可將 Ca2+ 內(nèi)流恢復(fù)到對照水平（圖2 H、I）。進(jìn)一步研究以探索 Ca2+ 對鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）磷酸化的下游影響，表明 Yoda1 增強(qiáng)了 CaMKII 磷酸化。有趣的是，選擇性抑制劑 KN-93 對 CaMKII 的抑制導(dǎo)致 Akt 磷酸化的劑量依賴性降低（圖2 J）。骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析顯示，DEX 處理后肌動蛋白交聯(lián)點(diǎn)增加，但這種增加通過同時使用 DEX 和 Yoda1 而劑量依賴性地減弱（圖2 K、L）。這些數(shù)據(jù)表明，Yoda1 通過鈣調(diào)蛋白激酶II-依賴性 Ca2+ 內(nèi)流介導(dǎo)對 DEX 誘導(dǎo)的基因表達(dá)、骨細(xì)胞形態(tài)和 Akt 磷酸化變化的抵抗。

圖2    DEX 和 Yoda1 對人皮質(zhì)骨和 MLO-Y4 細(xì)胞的影響。

為了研究糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的機(jī)械應(yīng)力反應(yīng)的機(jī)制，進(jìn)行了 RNA-seq 分析，比較了對照處理組和 DEX 處理組在 5 天內(nèi)的小鼠脛骨軸向負(fù)荷反應(yīng)。在負(fù)荷期間，對照組和 DEX 處理組之間的比較基因表達(dá)分析顯示，Piezo1 和 Tnfrsf11b（OPG）表達(dá)顯著降低，而 DEX 處理組的 Tnfrsf11a（RANK）表達(dá)增加。進(jìn)一步縮小對機(jī)械刺激反應(yīng)的骨細(xì)胞特異性基因的關(guān)注范圍，分析顯示 Hes1 是 LIPUS 處理后顯示上調(diào)的基因。

然后，研究了 Hes1 是否充當(dāng) Piezo1 的轉(zhuǎn)錄因子（圖3）。在 MLO-Y4 細(xì)胞中敲低 Hes1 后，發(fā)現(xiàn) Piezo1 表達(dá)在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上均降低（圖3 A 、B）。進(jìn)一步確認(rèn) Hes1 與 Piezo1 基因的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)用 Yoda1 處理顯著增強(qiáng)了 MLO-Y4 細(xì)胞中 Hes1 結(jié)合區(qū)的擴(kuò)增，而 DEX 處理和 Hes1 敲低則沒有（圖3 C、D）。此外，Piezo1 轉(zhuǎn)錄活性被 DEX 處理抑制，并被 Yoda1 顯著挽救（圖3 E）。同時，還研究了 DEX 和 Yoda1 處理在基因和蛋白質(zhì)水平上對 Hes1 表達(dá)的影響（圖3 F-H），發(fā)現(xiàn) DEX 處理誘導(dǎo) Hes1 mRNA 水平呈劑量依賴性降低，而 Yoda1 處理增加 Hes1 mRNA 水平（圖3 F、G）。值得注意的是，發(fā)現(xiàn) Hes1 磷酸化在 DEX 處理下降低，而在 Yoda1 處理下增加（圖3 H）。這些數(shù)據(jù)表明，Hes1 作為 DEX 和 Yoda1 調(diào)節(jié) Piezo1 的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。

圖3    Hes1 是由 DEX 和 Yoda1 調(diào)控的 Piezo1 的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。

小鼠模型（脛骨）和股骨頸 GIOP 患者的皮質(zhì)骨（包括骨膜）的翻譯分析揭示了與成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞功能相關(guān)的 10 個基因的列表。這一發(fā)現(xiàn)表明，在 GIOP 中，成骨前細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化受到抑制。為了進(jìn)一步研究這一點(diǎn)，比較了從全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)和 MC3T3-E1 細(xì)胞獲得的人 PDCs 中成骨細(xì)胞分化過程中的 Piezo1 表達(dá)（圖4 A ）。人 PDCs 在成骨細(xì)胞分化的早期顯示 Piezo1 表達(dá)上調(diào)，這被 DEX 處理抑制。然而，與 DEX 和 Yoda1 的共處理可顯著誘導(dǎo) Piezo1 表達(dá)（圖4 A）。相反，MC3T3-E1 細(xì)胞在 Piezo1 表達(dá)方面沒有表現(xiàn)出任何顯著變化。

最后，以 PDCs 為重點(diǎn)，對 10 個基因進(jìn)行定量 PCR 分析，發(fā)現(xiàn) 6 個基因 （ACAN、SOX9、SFRP1、SFRP2、SMOC1、COL14A1）在 DEX 處理后顯著下調(diào)，但Yoda1 處理顯著逆轉(zhuǎn)了這種效果（圖 4 B）。進(jìn)一步評估 DEX 和 Yoda1 處理對 PDCs 成骨細(xì)胞分化的影響（圖4 C-F），發(fā)現(xiàn)DEX 顯著降低了 ALP 活性，但當(dāng) DEX 和 Yoda1 同時使用時，這種影響得到了緩解（圖4 D）。同樣，當(dāng) DEX 和 Yoda1 聯(lián)合時，通過 DEX 處理顯著降低的茜素紅S 染色顯示出較弱的抑制（圖4 F）。這些數(shù)據(jù)表明，DEX 和 Yoda1 影響人 PDCs 中 Piezo1 的表達(dá)和成骨細(xì)胞分化。

圖4     DEX 和 Yoda1 對 PDCs 中 Piezo1 表達(dá)和成骨細(xì)胞分化的影響。

圖5     Yoda1 通過 Hes1/Piezo1 信號誘導(dǎo)骨細(xì)胞功能增強(qiáng)。

Yoda1 通過激活 Hes1 增強(qiáng) Piezo1 表達(dá)，增加骨細(xì)胞中的 CaMKII 和 Akt 磷酸化。這導(dǎo)致腔隙-小管網(wǎng)絡(luò)（LCN）得到改善，硬化蛋白產(chǎn)生減少，RANKL/OPG 比率平衡，這些影響被 DEX 減弱。

總之，該研究揭示了 GIOP 患者皮質(zhì)骨組織中 LCN 和 Piezo1 的表達(dá)下調(diào)。此外，GIOP 小鼠模型顯示對機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)減弱，突出了 Piezo1 在疾病進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。Yoda1 是一種 Piezo1 激活劑，其給藥抵消了 GIOP 模型中受損的機(jī)械應(yīng)力反應(yīng)。這項研究不僅提供了對 GIOP 病理生理學(xué)的見解，還通過靶向 Piezo1 激活和模擬機(jī)械應(yīng)力為該疾病提供了潛在的治療策略。

參考文獻(xiàn)：Ochiai N, Etani Y, Noguchi T, Miura T, Kurihara T, Fukuda Y, Hamada H, Uemura K, Takashima K, Tamaki M, Ishibashi T, Ito S, Yamakawa S, Kanamoto T, Okada S, Nakata K, Ebina K. The pivotal role of the Hes1/Piezo1 pathway in the pathophysiology of glucocorticoid-induced osteoporosis. JCI Insight. 2024 Dec 6;9(23):e179963. doi: 10.1172/jci.insight.179963. PMID: 39641269; PMCID: PMC11623955.

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