基于脂質(zhì)的藥物遞送系統(tǒng)在遞送小分子、蛋白質(zhì)和核酸方面具有廣泛應(yīng)用。特別是LNPs，在mRNA遞送中占據(jù)主導(dǎo)地位，這得益于mRNA-LNP 大流行相關(guān)疫苗的成功應(yīng)用。然而，mRNA-LNP的制造過(guò)程復(fù)雜且對(duì)工藝敏感，需要系統(tǒng)化的工藝開(kāi)發(fā)方法，包括數(shù)學(xué)建模和統(tǒng)計(jì)分析，以確保從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到工業(yè)規(guī)模的可擴(kuò)展性和產(chǎn)品質(zhì)量。本文研究了mRNA-LNP制造過(guò)程中切向流過(guò)濾（TFF）和無(wú)菌過(guò)濾的工藝開(kāi)發(fā)，重點(diǎn)探討了膜性能及過(guò)濾模型。通過(guò)測(cè)試不同TFF膜材料和工藝參數(shù)，優(yōu)化了TFF過(guò)程以提高mRNA-LNP的濃度，并分析了無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程中過(guò)濾模型的應(yīng)用，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了設(shè)計(jì)空間。本研究結(jié)果有助于開(kāi)發(fā)穩(wěn)健且可擴(kuò)展的mRNA-LNP制造工藝，確保產(chǎn)品質(zhì)量。
材料與方法
本研究使用由Providence Therapeutics Holdings Inc.提供的編碼SARS-CoV-2刺突蛋白的mRNA，濃度為2 mg/mL。脂質(zhì)混合物包括一種專有離子化脂質(zhì)、膽固醇、DSPC、DMG-PEG2000等，均購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商。
mRNA和脂質(zhì)溶液通過(guò)微流控快速混合，形成LNPs，隨后通過(guò)PBS稀釋穩(wěn)定。
1.3 切向流過(guò)濾與跨膜壓（TMP）實(shí)驗(yàn)：
使用Sartorius Stedim的Sartoflow SMART TFF系統(tǒng)，測(cè)試了Hydrosart ECO和Ultracel兩種TFF膜材料。在不同流量下進(jìn)行TMP實(shí)驗(yàn)，評(píng)估膜性能。
使用Sartorius Stedim的Sartoscale 25濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾實(shí)驗(yàn)，評(píng)估不同濾膜材料和預(yù)濾器孔徑對(duì)濾器容量的影響。
1.5 動(dòng)態(tài)光散射（DLS）與Ribogreen分析：
使用DLS分析LNPs的粒徑和分散性指數(shù)（PDI），通過(guò)Ribogreen分析測(cè)定mRNA的封裝效率和總濃度。
1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與ELISA分析：
使用Huh-7細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)ELISA分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中大流行相關(guān)疫苗刺突蛋白的表達(dá)水平。
結(jié)果與討論
2.1 TMP實(shí)驗(yàn)與膜性能：
在切向流過(guò)濾（TFF）過(guò)程中，研究評(píng)估了Hydrosart ECO和Ultracel兩種膜材料在不同流量（3, 4, 和5 L/m2/min）下的跨膜壓（TMP）實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hydrosart ECO膜在所有測(cè)試流量下均表現(xiàn)出更高的滲透通量和更短的工藝時(shí)間。具體而言，在5 L/m2/min的流量下，Hydrosart ECO膜的滲透通量約為100 LMH，而Ultracel膜的滲透通量約為80 LMH，表明Hydrosart ECO膜在mRNA-LNP過(guò)濾中具有更高的效率和性能。此外，歸一化水滲透性（NWP）測(cè)試顯示，兩種膜在使用前后NWP值無(wú)明顯差異，證實(shí)了膜的完整性和有效清潔。然而，Hydrosart ECO膜在過(guò)程中的實(shí)際表現(xiàn)優(yōu)于Ultracel膜，這可能與其較低的LNP-膜相互作用有關(guān)，從而減少了膜污染和吸附現(xiàn)象。
Fig. 1. TMP excursion experiments at various feed fluxes using (A) Hydrosart ECO and (B) Ultracel membranes. (C) Normalized water permeability (NWP) at 22 ?C before and after TFF processing. (D) Spike protein expression after Huh-7 cells transfection with mRNA-LNPs, fitted with a logistic 4-parameter function. (E) Particle size (nm) and PDI, and (F) encapsulation efficiency of post-TFF samples processed with different membranes.
2.2 過(guò)濾模型評(píng)估：
為了描述mRNA-LNP過(guò)濾過(guò)程中的通量衰減，研究評(píng)估了四種常見(jiàn)的過(guò)濾模型：全阻塞模型、逐漸堵塞模型、中間阻塞模型和濾餅過(guò)濾模型。通過(guò)將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與這些模型進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)逐漸堵塞模型提供了最佳擬合效果，其Akaike信息準(zhǔn)則（AIC）值最小，R2值最高。逐漸堵塞模型表明，隨著過(guò)濾的進(jìn)行，顆粒逐漸在膜孔內(nèi)積累，導(dǎo)致通量逐漸下降，這與研究在實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象一致。相比之下，全阻塞模型和濾餅過(guò)濾模型未能準(zhǔn)確描述mRNA-LNP過(guò)濾過(guò)程中的通量衰減行為。Fig. 2. Volumetric throughput (v) versus filtration time (t) fitting models for mRNA LNPs filtration using Sartopore 2 XLG filter under constant pressure
2.3 濾器篩選：
在無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程中，研究測(cè)試了不同濾膜材料和預(yù)濾器孔徑對(duì)濾器容量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)濾器孔徑對(duì)濾器容量有顯著影響。具體而言，使用較大孔徑（如0.8 µm）的預(yù)濾器可以顯著提高濾器容量。例如，在相同條件下，使用0.8 µm預(yù)濾器的Sartopore 2 XLG濾器相比使用0.45 µm預(yù)濾器的濾器，濾器容量提高了約10倍。此外，通過(guò)SEM觀察濾膜表面，研究發(fā)現(xiàn)較小孔徑的預(yù)濾器在過(guò)濾后膜孔堵塞更為嚴(yán)重，這進(jìn)一步證實(shí)了預(yù)濾器孔徑對(duì)濾器容量的影響。
在重復(fù)過(guò)濾實(shí)驗(yàn)中，研究使用之前已通過(guò)Sartopore 2 XLG濾器過(guò)濾的產(chǎn)品進(jìn)行再次過(guò)濾，發(fā)現(xiàn)濾器容量進(jìn)一步提高，表明大部分污染物已在第一次過(guò)濾中被去除。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于優(yōu)化無(wú)菌過(guò)濾工藝具有重要意義，因?yàn)樗砻髟趯?shí)際生產(chǎn)中，可以通過(guò)增加預(yù)過(guò)濾步驟來(lái)提高濾器使用效率，從而降低生產(chǎn)成本。
Table 2 Filter capacity (vmax) and Initial flux (J0) for various filter types at different filtration stages. 1.0 mg/mL mRNA-LNPs filtration was performed at a constant pressure of 68.9 kPa. Refiltration experiments were conducted using a product previously filtered through a Sartopore 2 XLG filterFig. 3. Plot of volumetric throughput (v) versus filtration time (t) during mRNA-LNP filtration, comparing different filter types and filtration stages. Solid lines represent gradual plugging model fits to the experimental data. Refiltration experiments were conducted using product previously filtered through a Sartopore 2 XLG filter.Fig. 4. SEM images of Sartoscale 25 filters used for filtering 1 mg/mL mRNA-LNP drug product: Outlet side of the Sartopore 2 XLG 0.8 µm layer (A) before and (B) after use; outlet side of the Sartopore 2 0.45 µm layer (C) before and (D) after use; inlet side of the Sartopore 2 XLG 0.2 µm layer (E) before and (F) after use; inlet side of the Sartopore 0.2 µm layer (G) before and (H) after use.2.4 mRNA-LNP濃度對(duì)過(guò)濾過(guò)程的影響：研究研究了不同mRNA-LNP濃度（0.25, 0.5, 1.0, 和1.5 mg/mL）對(duì)過(guò)濾過(guò)程的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著mRNA-LNP濃度的增加，濾器容量顯著降低。具體而言，在137.9 kPa的恒定壓力下，1.5 mg/mL的mRNA-LNP溶液的濾器容量?jī)H為1.91 L/m2，而0.25 mg/mL的溶液濾器容量則高達(dá)14.4 L/m2。這可能是由于高濃度溶液具有較高的粘度，增加了過(guò)濾過(guò)程中的阻力。此外，隨著濃度的增加，初始過(guò)濾通量也顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了粘度對(duì)過(guò)濾過(guò)程的影響。Fig. 5. Filtrate flux (J) versus volumetric throughput (v) of mRNA LNP with various mRNA concentrations using Sartopore 2 XLG under a constant pressure of 137.9 kPa.2.5 過(guò)濾壓力對(duì)濾器容量的影響：研究研究了不同過(guò)濾壓力（34.5, 68.9, 103.4, 和137.9 kPa）對(duì)濾器容量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著過(guò)濾壓力的增加，濾器容量先顯著增加后趨于平穩(wěn)。具體而言，在103.4 kPa和137.9 kPa的壓力下，濾器容量無(wú)顯著差異。這一發(fā)現(xiàn)表明，在實(shí)際生產(chǎn)中，通過(guò)增加過(guò)濾壓力可以在一定程度上提高濾器容量，但過(guò)高的壓力可能不會(huì)帶來(lái)額外的收益。此外，研究還發(fā)現(xiàn)初始過(guò)濾通量與過(guò)濾壓力呈線性關(guān)系，符合達(dá)西定律。Fig. 6. (A) Particle size distribution graphs by intensity of post-filtration samples at different filtration pressure (B) Contour plot of estimated volumetric throughput (v) as a function of filtration time (t) and filtration pressure (p). The gradual plugging model was extended to v = f (t, p) based on the experimental data, incorporating the effect of filtration pressure.2.6 最終mRNA-LNP產(chǎn)品表征：通過(guò)Cryo-TEM觀察優(yōu)化后的工藝參數(shù)生產(chǎn)的mRNA-LNP，研究發(fā)現(xiàn)粒子呈球形，具有均勻的粒徑分布（約50 nm）和清晰的電子致密核心。此外，部分粒子表面觀察到小的月牙形突起（blebs），這可能與mRNA與脂質(zhì)的部分性結(jié)合有關(guān)。然而，這些blebs并未對(duì)mRNA-LNP的體外轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生顯著影響（未展示數(shù)據(jù)）。DLS分析顯示，優(yōu)化后的mRNA-LNP的Z平均粒徑為79.9 nm，PDI為0.072，表明粒子具有較高的均勻性。Ribogreen分析顯示，mRNA的封裝效率高于95%，表明在優(yōu)化后的工藝參數(shù)下，mRNA得到了有效的封裝和保護(hù)。最終產(chǎn)品的這些特性證明了優(yōu)化后的工藝參數(shù)能夠生產(chǎn)出高質(zhì)量的mRNA-LNP。Fig. 7. Cryogenic transmission electronic microscopy (Cryo-TEM) images of mRNA-LNPs after one freeze–thaw cycle (A and B). A few particles show bleb structures (black arrows).結(jié)論
本研究系統(tǒng)地評(píng)估了mRNA-LNP制造中TFF和無(wú)菌過(guò)濾的工藝開(kāi)發(fā)，發(fā)現(xiàn)Hydrosart ECO膜在TFF過(guò)程中表現(xiàn)出色，逐漸堵塞模型最匹配描述過(guò)濾過(guò)程。通過(guò)優(yōu)化預(yù)濾器孔徑和過(guò)濾壓力，顯著提高了濾器容量和過(guò)濾效率。本研究結(jié)果為mRNA-LNP的大規(guī)模生產(chǎn)提供了有價(jià)值的見(jiàn)解，有助于開(kāi)發(fā)穩(wěn)健且可擴(kuò)展的制造工藝。參考文獻(xiàn)：Wu, Wenjun, et al. "Process development of tangential flow filtration and sterile filtration for manufacturing of mRNA-lipid nanoparticles: A study on membrane performance and filtration modeling." International Journal of Pharmaceutics (2025): 125520.
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