從來源到應(yīng)用！揭秘DNase I的價值！

引 言

DNase I的來源

DNase I最初主要從牛胰腺中純化得到。牛胰腺是RNase A的豐富來源，因此對于牛胰來源的DNase I去除RNase A的工藝非常關(guān)鍵；牛胰來源的DNase I的優(yōu)勢在于，來源廣，能實現(xiàn)批量化生產(chǎn)，酶活高等優(yōu)點；但是牛胰腺中可能含有其他雜質(zhì)和污染物，增加了純化的難度；另一方面，有些生物制品不能接受動物來源的DNase I，這時需要重組來源的DNase I來替換。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，開始采用重組技術(shù)生產(chǎn)DNase I。目前，常見的重組表達系統(tǒng)包括酵母畢赤酵母和大腸桿菌（E. coli）菌株。這種生產(chǎn)方式可以降低污染RNase的水平。在重組大腸桿菌菌株中表達的DNase I，不含RNase，可用于各種RNA樣品的處理，如RNA提取或反轉(zhuǎn)錄前去除基因組DNA，體外轉(zhuǎn)錄去除模板DNA等。重組技術(shù)的運用使得DNase I的生產(chǎn)更加高效、安全，并且能夠更好地滿足不同實驗和應(yīng)用的需求。但是重組技術(shù)生產(chǎn)DNase I既要實現(xiàn)高酶活，又要放大發(fā)酵工藝，確保低殘留，這種工藝實現(xiàn)的難度較大，成本較高。

DNase I的作用原理

DNase I首先通過靜電相互作用與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的磷酸骨架結(jié)合。

與DNA分子結(jié)合后，DNase I的活性中心結(jié)構(gòu)域與DNA分子作用。使底物分子的磷酸二酯鍵斷裂，生成相應(yīng)的寡核苷酸片段。

DNase I的活性依賴于鈣離子（Ca2?），并能被鎂離子（Mg2?）或二價錳離子（Mn2?）激活。

DNase I的用途

在RNA提取過程中，常常會混入基因組DNA，這些DNA會對后續(xù)的實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。例如，在進行mRNA表達量分析、轉(zhuǎn)錄組分析、RT—qPCR等下游實驗時，DNA的存在會導(dǎo)致實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。DNase I可以有效地去除RNA樣品中的DNA污染，提高RNA的純度。在提取RNA時，可以在裂解細胞后加入適量的DNase I，并在適宜的條件（37℃、pH=7—8）下進行孵育一段時間，DNase I將會發(fā)揮作用，特異性降解DNA分子，再進行后續(xù)的RNA提純處理。該應(yīng)用場景下，牛胰來源和重組來源都適用，牛胰來源的應(yīng)用相對更廣泛。

在體外轉(zhuǎn)錄實驗中，常用T7、T3、SP6等RNA聚合酶進行RNA合成。然而，合成后的RNA可能會有DNA殘留，若用于mRNA疫苗生產(chǎn)制作，則必須用DNase I去除模板DNA殘留，且不能引入會引起免疫反應(yīng)的雜質(zhì)。例如，在制備mRNA疫苗時，需要確保RNA樣品中不含有任何DNA污染，否則可能會影響疫苗的安全性和有效性。DNase I能夠高效地去除模板DNA，保證RNA疫苗的質(zhì)量。

1. rRNAq去除，常應(yīng)用于RNA建庫測序
在酶法rRNAq去除實驗步驟中，單鏈DNA探針和rRNA分子雜交結(jié)合；RNase H降解雜交的rRNA； DNase I降解DNA 探針；
2、DNase I足跡實驗（DNase I footprinting），其原理是蛋白結(jié)合在DNA片段上，能保護結(jié)合部位不被DNase I破壞，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段（即“足跡”)，進而可以確定其序列。
3. 缺口平移（nick translation）；該方法是DNase I與E.coli DNA Polymerase I的聯(lián)合作用實現(xiàn)的。
4. 細胞凋亡TUNEL檢測。

DNaseI選擇指南