基于WGS的新生兒重癥監(jiān)護室罕見病快速診斷文庫制備自動化

簡介

迪拜Al Jalila兒童專科醫(yī)院的基因組學中心（CoE）利用Hamilton液體處理工作站的自動化功能，為新生兒重癥監(jiān)護室的兒童提供基于全基因組測序（rWGS）的快速檢測。這個名為“小獵鷹”的項目將對200名兒童及其父母進行測序，目的是證明這種方法在這種醫(yī)療環(huán)境中診斷速度和患者整體護理方面的實用性。本案例研究描述了基因組學CoE如何通過使用Hamilton液體處理工作站，實現自動化rWGS文庫制備流程，從而提高準確性、可重復性、無人值守時間、通量和靈活性。

關于Al Jalila兒童?？漆t(yī)院

Al Jalila兒童專科醫(yī)院（AJCH）于2016年11月1日落成，是阿拉伯聯合酋國家兒童專科醫(yī)院。AJCH共有1000多名員工，包括醫(yī)生、護士、專家和臨床支持人員，分為六個CoE，每個CoE都有自己的專長：腎臟、神經科學、心臟、兒童和青少年心理健康、重癥監(jiān)護和基因組學。

Al Jalila兒童專科醫(yī)院的基因診斷技術在AJCH的新生兒重癥監(jiān)護室，基因組學CoE發(fā)揮著至關重要的作用，為各種兒科疾病和綜合征提供早期診斷測試。這些疾病包括與聽力損失、腸胃病學、肺病、骨骼和結締組織、內分泌學、免疫學和風濕病學有關的疾病。

基因組學實驗室利用下一代測序技術（NGS）、如全外顯子測序（WES）、全基因組測序（WGS）、以及芯片（染色體芯片）、液滴數字PCR (ddPCR) 和Sanger測序等先進技術，提供定制的精準基因檢測服務。

2022年，基因組學CoE開發(fā)了一個名為“小獵鷹”的項目，旨在兩年內為200個家庭提供基于rWGS的檢測（共600個個體的三重分析）。為了實現這一目標，基因組學CoE依靠12名專業(yè)員工，包括一名美國委員會認證的臨床分子遺傳學家、生物信息學科學家、基因組分析師、分子技術專家和遺傳顧問。

基因診斷自動化

起初，基因組學CoE以人工方式進行所有檢測。然而，隨著該公司開始成為中東地區(qū)較大的基因檢測平臺，提高通量和可重復性成為當務之急。

Tayoun博士解釋了他選擇Hamilton系統(tǒng)實現工作流程自動化的決定： “在加入AJCH 之前，我曾在費城兒童醫(yī)院使用過Hamilton儀器。Hamilton儀器的技術特點和可靠性都非常出色，因此當我們開始在AJCH的基因組學部門實現工作流程自動化時，Hamilton是我們很好的選擇。

基因組學CoE目前有兩個Hamilton Microlab®NGS STAR，其中五個工作流程已經自動化。這些工作流程包括基因分型、DNA稀釋和WES和rWGS文庫制備。嚴格的驗證過程正在進行中或已經完成，以確保其適用于診斷目的。在本案例研究中，我們重點關注用于小獵鷹項目測試的rWGS庫準備工作流程的自動化。

rWGS文庫制備自動化工作流程

小獵鷹項目 rWGS 的整個過程包括七個階段：(1) 樣品采集；(2) DNA 提?。?3) WGS 文庫制備；(4) 定量和匯集；(5) 測序；(6) 分析；(7) 結果交付。

El Naofal女士更詳細地描述了這一過程： “首先用EDTA管采集外周血樣本（受試者和父母），然后用QIAGEN QIAsymphony 儀器提取基因組DNA。提取gDNA后，將其與文庫制備所需的耗材和試劑一起擺放到Hamilton Microlab®NGS STAR的臺面上。制備好的NGS文庫使用賽默飛世爾科技公司的Qubit 4.0熒光儀檢測文庫的濃度，而后在Illumina NovaSeq 6000平臺上進行測序。測序結束后，生物信息學團隊會立即對結果進行內部分析，并在樣本采集后48到72小時內將結果告知患者。 這種方法之所以被稱為“快速”，是因為從樣本采集到結果通報的時間很短。

系統(tǒng)描述

用于 rWGS 文庫制備的系統(tǒng)是基于Hamilton Microlab® NGS STAR，該系統(tǒng)有八個 1000 μL移液通道、一個 CO-RE® 抓手工具、一個磁力架、五個Hamilton加熱振動器（HHS）和兩個用于控溫孵育的 INHECO CPAC。

自動化流程描述

如前所述，rWGS文庫制備方法基于Illumina的DNA PCR自由文庫制備試劑盒在Hamilton液體處理器上的自動化（第3階段）。自動化工作流程包括四個主要步驟。

1.     Tagmentation of the Genomic DNA

2.     Post-Tagmentation Clean-up 

3.     Index Ligation 

4.     Post-index Library Clean-up

Hamilton Microlab® NGS STAR可自動處理這四個步驟。Hamilton實驗室自動化顧問Murad Sharabati先生進一步描述：“NGS STAR上的這種方法非常簡單，用戶友好。NGS STAR中的自動條形碼閱讀器可讀取試劑盒中管的條碼信息，并將信息輸入VENUS軟件。用戶只需手動將一些耗材（如無核酸酶的水）擺放到平臺上的50毫升槽中。對于步驟1 (tagmentation) 和3 (index ligation)，通過使用Hamilton 加熱振蕩器實現孵育步驟。因該步驟不需要溫度變化，因此無需使用臺面熱循環(huán)儀 (ODTC)，從而降低了總體成本。此外，HHS還用于某些步驟中的混合，減少了所需的耗材量和處理時間。純化（步驟2和4）依賴于臺面上的磁力架。為了在這些步驟中最大限度地確保樣品的均一性，我們設計了一個批處理程序。該程序利用8個1000 µL 移液通道串聯處理3個批次，然后繼續(xù)處理后面的3個批次，依此類推。這樣既縮短了處理時間，又保證了結果的一致性和準確性"。完成這四個自動化 NGS 文庫制備核心工作流程步驟后，文庫將進行人工定量和匯集。Hamilton基因組學高級細分市場負責人Birgit Ottenw?lder博士對這些額外工作流程步驟的潛在自動化發(fā)表了評論：如果需要，定量和匯集步驟也可以使用Hamilton的NGS STAR進行自動化。特別是定量步驟，可通過第三方設備整合或通過Hamilton用于熒光檢測的新型臺面模塊FLUOREYE實現自動化。定量和匯集步驟通常是為滿足客戶的個性化要求和實驗室設置而定制的。因此，這些步驟可根據要求添加到我們經 Hamilton驗證或合作伙伴認證的NGS文庫制備核心方法中。

WGS文庫制備自動化的優(yōu)勢

準確性和可重復性 

自動化可大幅降低錯誤率，這得益于工作流程的標準化以及消除了操作員引起的變化和偶然錯誤。液體處理技術的精確性和準確性可確保減少在錯誤處理和潛在重復上浪費的時間，從而全面提高診斷速度?；蚪M學CoE目前正在對用于診斷的自動化工作流程進行全面驗證（超出了小獵鷹項目的臨床研究目的）。初步結果表明，所有質量標準都與人工處理的質量標準相似或更好。圖4顯示，在自動化處理過程中，所有測試樣本的基因組覆蓋率均超過90%。

無人值守時間

自動化的主要優(yōu)勢之一是能讓科學家大大減少 “動手時間”，這在NGS文庫制備等長時間工作流程中尤為有用。使用手動方法，24個樣本需要3到4個小時的動手工作，而使用Hamilton系統(tǒng)，只需要30到45分鐘的動手時間。

通量

自動化工作流程允許同時運行多達96個樣本。盡管小獵鷹項目的目標是在兩年內對600個樣本進行測序，但其目的是將這一自動化工作流程添加到醫(yī)院的標準遺傳學服務列表中。AJCH的基因組學CoE預計每月運行100至150個樣本。

靈活性

來自不同供應商的多種方法可在同一Hamilton NGS STAR工作站上實施，在這些方法之間切換只需交換幾個載架。對于運行多種方法/測定的客戶來說，將Hamilton自動化系統(tǒng)用于各種用途的能力尤其具有吸引力。