概述
活/死細(xì)胞雙染色試劑盒在細(xì)胞分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,可精準(zhǔn)區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞,助力細(xì)胞活性評(píng)估、藥物篩選及細(xì)胞凋亡研究等。其操作簡便、靈敏度高,結(jié)果可通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直觀呈現(xiàn)。
前處理
細(xì)胞準(zhǔn)備
無論是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞,在進(jìn)行雙染色前需確保細(xì)胞狀態(tài)良好,密度適宜。細(xì)胞密度過高或過低均會(huì)影響染色效果及后續(xù)檢測準(zhǔn)確性。懸浮細(xì)胞直接取適量細(xì)胞懸液,用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 - 3 次,離心去除培養(yǎng)基及雜質(zhì)。貼壁細(xì)胞則先用胰酶消化,制成單細(xì)胞懸液,再按上述方法洗滌。洗滌過程動(dòng)作輕柔,避免細(xì)胞過度離心導(dǎo)致?lián)p傷。
試劑準(zhǔn)備
活/死細(xì)胞雙染色試劑盒通常包含兩種熒光染料,一種用于標(biāo)記活細(xì)胞,如綠色熒光染料 Calcein-AM,另一種用于標(biāo)記死細(xì)胞,如紅色熒光染料 PI(碘化丙啶)。使用前,先檢查試劑是否在有效期內(nèi),是否有變色、沉淀等現(xiàn)象。若有異常,不可使用。取適量染料,按試劑盒說明書推薦的比例用無菌水或 PBS 稀釋,配制成工作液。例如,Calcein-AM 常用濃度為 1 - 10 μM,PI 常用濃度為 1 - 20 μg/mL。配制好的工作液應(yīng)立即使用,避免長時(shí)間放置導(dǎo)致活性下降。
染色步驟
加入染色液
將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液與染色工作液按一定比例混合,輕輕吹打混勻,使染料均勻分布于細(xì)胞周圍。對(duì)于 96 孔板培養(yǎng)的細(xì)胞,一般每孔加入 100 μL 染色工作液和 10 μL 細(xì)胞懸液,確保細(xì)胞充分接觸染料。
孵育
置于 37℃、5% CO?的培養(yǎng)箱中孵育 15 - 30 分鐘。孵育時(shí)間不宜過長,否則可能影響細(xì)胞活性,導(dǎo)致染色結(jié)果偏差。孵育過程中,細(xì)胞攝取染料并進(jìn)行代謝反應(yīng)。Calcein-AM 在活細(xì)胞內(nèi)經(jīng)酯酶作用轉(zhuǎn)化為具有熒光的 Calcein,發(fā)出綠色熒光;PI 則能穿透死細(xì)胞破損的細(xì)胞膜,與細(xì)胞核中的 DNA 結(jié)合,發(fā)出紅色熒光。
觀察與記錄
熒光顯微鏡觀察
孵育結(jié)束后,立即將染色后的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察。選擇合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長,Calcein-AM 的激發(fā)波長為 490 - 515nm,發(fā)射波長為 515 - 530nm;PI 的激發(fā)波長為 535nm,發(fā)射波長為 617nm。通過調(diào)整光強(qiáng)和焦距,清晰看到綠色熒光標(biāo)記的活細(xì)胞和紅色熒光標(biāo)記的死細(xì)胞,可拍攝多張照片,記錄細(xì)胞形態(tài)及分布情況。
流式細(xì)胞儀分析
對(duì)于高通量、定量分析,將染色后的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測。設(shè)置合適的熒光通道,收集至少 10?個(gè)細(xì)胞的信號(hào),得到散點(diǎn)圖,橫軸為 PI 熒光強(qiáng)度(代表死細(xì)胞),縱軸為 Calcein-AM 熒光強(qiáng)度(代表活細(xì)胞)。根據(jù)細(xì)胞在圖中的分布情況,準(zhǔn)確計(jì)算活細(xì)胞和死細(xì)胞的比例。
注意事項(xiàng)
操作環(huán)境
整個(gè)操作過程需在無菌環(huán)境下進(jìn)行,避免雜菌污染影響細(xì)胞狀態(tài)及染色結(jié)果。使用無菌移液器、離心管等器具,細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)等設(shè)備定期清潔消毒。
細(xì)胞處理
操作細(xì)胞時(shí)動(dòng)作輕柔,避免用力吹打或劇烈振蕩,防止細(xì)胞受損。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí),使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板準(zhǔn)確計(jì)數(shù),確保細(xì)胞濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。
試劑使用
嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,不同品牌、型號(hào)的試劑盒組分和使用方法可能存在差異。使用過程中,避免染料接觸皮膚和眼睛,一旦接觸,立即用大量清水沖洗。
后續(xù)處理
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,妥善處理廢棄物,如含染料的廢液、一次性耗材等,避免對(duì)環(huán)境造成污染。將未用完的試劑按說明書要求保存,如 4℃避光保存,以備下次使用。
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