過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(鉬酸銨微板法)說明書

產(chǎn)品簡介：

過氧化氫酶(Catalase，CAT)又稱觸酶，是一類以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶，由四個相同亞單位組成的四聚體酶，共含4分子的亞鐵血紅素作為輔基，分子量約為24KD，CAT能將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)過氧化氫迅速清除，可與 GSH-Px 共同保護(hù)巰基酶、膜蛋白、過氧化氫解離。

自備材料：
1、蒸餾水、生理鹽水
2、研缽或勻漿器、離心管、離心機(jī)、水浴鍋或恒溫箱、酶標(biāo)儀、96 孔板
操作步驟(僅供參考)： 
1、配制65mM H2O2基液：本試劑盒提供的 H2O2 基液中的H2O2濃度約為1M，由于過氧化氫不是非常穩(wěn)定，使用前需自行測定過氧化氫的實(shí)際濃度，把濃度約為1M的H2O2基液用本CAT Assay Buffer稀釋100倍，使H2O2基液中的 H2O2 濃度約為10mM；分光光度計(jì)測定A240(一般情況下新配制的10mM H2O2 基液A240在0.4~0.45左右，經(jīng)過3個月以后A240 在0.35~0.4 左右)，H2O2濃度(mM)=22.94×A240，進(jìn)而計(jì)算出本試劑盒提供的H2O2基液中的H2O2的實(shí)際濃度，然后再根據(jù)實(shí)際的過氧化氫濃度， 配制65mMH2O2基液。
2、配置MO顯色液：稱取0.4g鉬酸銨試劑加入到 10ml 蒸餾水中，充分溶解即成，MO顯色液易出現(xiàn)乳白色樣物質(zhì)，應(yīng)棄用，盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，該試劑盒提供的鉬酸銨試劑為過量。 

3、準(zhǔn)備樣品：
①細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織進(jìn)行裂解，可以采用 RIPA裂解液，如有必要可進(jìn)行適當(dāng)勻漿，低速離心取上清，-20℃凍存，用于CAT的檢測。
②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備，用生理鹽水10倍稀釋后，可以直接用于本試劑盒的測定，尿液通常也可以直接測定，不能及時檢測可-20℃凍存。
③全血樣品：收集適量的全血至一抗凝管內(nèi)，顛倒混勻，取全血凍融一次，用CAT Assay Buffer 1000倍后進(jìn)行CAT檢測。
④血液中的紅細(xì)胞裂解液：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少 500μl 全血 4℃ 3000g 離心 5min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的生理鹽水洗滌3次，用約5倍細(xì)胞體積的預(yù)冷的去離子水，例如 Milli-Q 純水，重懸細(xì)胞沉淀，冰浴 10min；使用前用 CAT Assay Buffer 稀釋400倍后進(jìn)行CAT檢測。
⑤植物樣品：準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.5g，剪碎，置于4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中，加入預(yù)冷提取液 1ml，低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，用3ml 提取液沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管，加提取液至總體積為 5ml；4℃ 10000r/min 離心20min，上清液為酶提取液，上清液可用于CAT的檢測。提取液配方：無水磷酸氫二鈉
3.3g+二水磷酸二氫鈉 0.13g，補(bǔ)水至 200ml，溶解即為提取液，4℃保存?zhèn)溆?。注意：如?CAT 酶活性較低，應(yīng)相應(yīng)減少提取液的總體積，以便提高CAT 酶的濃度。
⑥高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的CAT，可以使用CAT Assay Buffer 稀釋。
⑦(選做)樣品準(zhǔn)備完畢后可以用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續(xù)計(jì)算單位蛋白重量組織或細(xì)胞內(nèi)的CAT含量。 

注意事項(xiàng)：

1、 該試劑盒亦可用分光光度計(jì)進(jìn)行測定，但檢測的樣本數(shù)相應(yīng)減少。
2、 待測樣品中不應(yīng)含有CAT抑制劑，同時需避免反復(fù)凍融。
3、 CAT Assay Buffer 如果出現(xiàn)渾濁或絮狀物，應(yīng)棄用。
4、 MO顯色液配置后可4℃穩(wěn)定兩周，如果出現(xiàn)乳白色物質(zhì)應(yīng)棄用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
5、 對于植物樣品研磨處理應(yīng)迅速，以免CAT酶活下降，同時盡量置于冰浴狀態(tài)處理；另外本法不推薦用于植物樣本CAT的檢測，最好采用過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(紫外比色法)。
6、 完整的紅細(xì)胞以及未稀釋的溶血液中的過氧化氫酶置于4℃ 1周仍然較穩(wěn)定，稀釋后的溶血液中CAT容易失活。
7、 盡量避免冰凍樣品造成溶血，否則過氧化氫酶活性會下降10~15%。
8、 血清樣品室溫下3天內(nèi)活性下降 64.7%，4℃條件下下降 10.5%，-20℃保存30天活性僅下降3.5%，因此待測樣品均應(yīng)-20℃或-70℃保存。

9、 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

10、試劑開封后請盡快使用，以防影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果。

有效期：12 個月有效；低溫運(yùn)輸，按要求保存。