培養(yǎng)基的配制與保存及質(zhì)量控制與注意事項(xiàng)！

一、物理性狀的質(zhì)量控制

應(yīng)包括20℃-25℃時(shí)的pH,并應(yīng)觀(guān)察以下內(nèi)容：加入培養(yǎng)基的量和(或)瓊脂層的厚度、顏色、透明度、是否存在肉眼可見(jiàn)的雜質(zhì)、凝膠穩(wěn)定性/黏稠度(一致性)、濕度。

滅菌前后都應(yīng)測(cè)定pH,采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極測(cè)定液體培養(yǎng)基的pH，固體培養(yǎng)基可用平頭電極或者連接微型探頭的電極測(cè)定pH,測(cè)量時(shí)盡量使培養(yǎng)基溫度降到20℃-25℃，校正通常用接近40g/L的氫氧化鈉或者1mol/L的鹽酸。

二、微生物的質(zhì)量控制

1、污染檢測(cè)

在每批制備好的培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)選取部分樣品進(jìn)行污染測(cè)試。

2、質(zhì)控菌株

質(zhì)控菌種應(yīng)具有穩(wěn)定特性，能代表其種并能有效地證明實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)基的性能。測(cè)試菌種應(yīng)可溯源至國(guó)家或的菌種收藏中心，也可以是實(shí)驗(yàn)室自己分離的具有良好特性的菌種，但必須對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢測(cè)和記錄儲(chǔ)存菌株(stock culture)的相關(guān)特性，新復(fù)蘇的菌種可能會(huì)有非特異性反應(yīng)。使用從食品中分離的菌種。

培養(yǎng)基的質(zhì)控菌種應(yīng)具備以下性能：具典型反應(yīng)的強(qiáng)陽(yáng)性菌種；弱生長(zhǎng)的陽(yáng)性菌種(選擇更敏感的菌種);無(wú)生化反應(yīng)的菌種；抑制菌種。

3、質(zhì)控方法

國(guó)際食品微生物委員會(huì)和培養(yǎng)基菌種衛(wèi)生工作組(WPCM)介紹了培養(yǎng)基評(píng)估用測(cè)試菌種的有效收集方法。

(1)即用培養(yǎng)基和試劑：商品化即用培養(yǎng)基的生產(chǎn)廠(chǎng)家如果經(jīng)過(guò)IS0 9001和ISO 9002體系認(rèn)證或滿(mǎn)足相應(yīng)質(zhì)量要求，應(yīng)向使用方提供資質(zhì)證明。這時(shí)，使用者就不必對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行大量的測(cè)試工作，但必須保證其儲(chǔ)存條件。

(2)采用商品化合成脫水培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)基：按ISO/TS 11133-1: 2009 《食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué) 培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則》的要求，除了對(duì)每批制備好的培養(yǎng)基用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行測(cè)試外，還應(yīng)用實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，以更好地保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。對(duì)于不含指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，只需用陽(yáng)性測(cè)試菌種進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于含有指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，必須使用能證明其指示或選擇作用的菌種進(jìn)行試驗(yàn)。對(duì)于復(fù)合培養(yǎng)基，即需要加入添加成分的培養(yǎng)基，要用具備上述性能的菌種逐批進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的需加入添加成分的制成培養(yǎng)基同樣適用。

(3)按照培養(yǎng)基配方制備的培養(yǎng)基：建議除了按照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)基品質(zhì)測(cè)試外，還要用改良的Miles-Misra技術(shù)、螺旋平板技術(shù)或菌落總數(shù)技術(shù)進(jìn)行測(cè)試，以監(jiān)控基礎(chǔ)材料的質(zhì)量、培養(yǎng)基性能和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的配制規(guī)范。實(shí)際上，食品中包含有應(yīng)激反應(yīng)的微生物，還應(yīng)考慮到培養(yǎng)基在應(yīng)激細(xì)菌恢復(fù)方面的適用性。

三、培養(yǎng)基性能測(cè)試方法

實(shí)驗(yàn)室可采用半定量和定量技術(shù)對(duì)固體、液體培養(yǎng)基的性能進(jìn)行測(cè)試，在多數(shù)情況下能滿(mǎn)足對(duì)培養(yǎng)基性能測(cè)試的要求。

對(duì)于特殊情況，如評(píng)價(jià)一種新的培養(yǎng)基或一個(gè)新的生產(chǎn)商的產(chǎn)品等，應(yīng)采用定量測(cè)試法。

1、固體培養(yǎng)基

應(yīng)用于固體培養(yǎng)基質(zhì)控程序的技術(shù)大都依靠菌落計(jì)數(shù)。主要應(yīng)用的技術(shù)有：傾注法、涂布法、旋轉(zhuǎn)涂布法、改良的Miles-Misra方法、半定量劃線(xiàn)法和定性劃線(xiàn)法。這些方法作為食品實(shí)驗(yàn)室的日常方法得到了。由于傾注法、涂布法及螺旋涂布法在日常工作中經(jīng)常使用，這里不再介紹，著重介紹一下改良的Miles -Misra方法、半定量劃線(xiàn)法和定性劃線(xiàn)法。

(1)改良的Miles-Misra方法：該方法是通過(guò)測(cè)試培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率(productivity ratio, PR)來(lái)檢查培養(yǎng)基的性能，通常與對(duì)照培養(yǎng)基相比。對(duì)照培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)是富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，如：胰酪胨大豆瓊脂。

該方法步驟如下：

①將試驗(yàn)菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物用緩沖蛋白胨水10倍梯度稀釋。

②將試驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)基做成4mm厚的平板，并使平板表面干燥。

③從稀釋度(如10-5)開(kāi)始，分別滴1滴稀釋液于試驗(yàn)平板和對(duì)照平板標(biāo)記好的區(qū)域。

④每個(gè)稀釋度各取4滴分別加入4個(gè)試驗(yàn)和對(duì)照培養(yǎng)基，每1滴的涂布超過(guò)四分之一平板，并用涂布器從高稀釋度開(kāi)始涂布，37 ℃培養(yǎng)18h。

⑤對(duì)數(shù)量和菌落形態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

評(píng)價(jià)方法，即按下列方式計(jì)算：PR=Ns/No

式中：

PR--生長(zhǎng)率；

Ns-試驗(yàn)培養(yǎng)基的菌落數(shù)；

No-對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)。

示例：在10-3稀釋度，試驗(yàn)培養(yǎng)基上為20個(gè)菌落，對(duì)照培養(yǎng)基上為25個(gè)菌落，則PR=0.80。

你真的會(huì)平板劃線(xiàn)嗎？平板劃線(xiàn)這樣操作才藝術(shù)……

(2)半定量劃線(xiàn)法

使用本方法時(shí)，所有測(cè)試培養(yǎng)基應(yīng)干燥到相同程度，且整個(gè)步驟應(yīng)標(biāo)注化，以便于比較同批次培養(yǎng)基的測(cè)試結(jié)果。

用1uL接種環(huán)劃線(xiàn)平板。在A(yíng)區(qū)用接種環(huán)按0.5cm的間隔劃4條平行線(xiàn)，按同樣的方法：B區(qū)和C區(qū)劃線(xiàn)，最后在D區(qū)內(nèi)劃一條線(xiàn)。按標(biāo)準(zhǔn)方法所規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

通常情況下用同一接種環(huán)對(duì)A區(qū)~D區(qū)進(jìn)行劃線(xiàn)，在不同區(qū)域劃線(xiàn)時(shí)不需對(duì)接種環(huán)滅菌。但為了得到低生長(zhǎng)指數(shù)G1,在A(yíng)區(qū)和B區(qū)接種應(yīng)更換接種環(huán)或?qū)ζ溥M(jìn)行滅菌。

評(píng)價(jià)方法：培養(yǎng)后，評(píng)估菌落的形狀、大小和密度，并計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)G1。每條有菌落生長(zhǎng)的劃線(xiàn)記作1分，每個(gè)培養(yǎng)皿上最多為16分。如果僅一半的線(xiàn)有菌落生長(zhǎng)，記作0.5分。如果劃線(xiàn)上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)量少于劃線(xiàn)一半，則記作0分。記錄每個(gè)平板的得分總和便得到G1。例如：菌落在A(yíng)區(qū)和B區(qū)全部生長(zhǎng)，而在C區(qū)有一半線(xiàn)生長(zhǎng)，則G1為10。

目標(biāo)菌的生長(zhǎng)指數(shù)G1大于6時(shí)，則判定培養(yǎng)基可接受。非選擇性培養(yǎng)基的G1值通常更高。目標(biāo)菌應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長(zhǎng)，而非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)應(yīng)部分或被抑制。

(3)定性劃線(xiàn)法

該方法只是定性測(cè)試，劃線(xiàn)培養(yǎng)后，按照要求進(jìn)行打分，得分是指示性的，可用作固體培養(yǎng)基性能測(cè)試的補(bǔ)充。

取1uL測(cè)試菌株培養(yǎng)物在測(cè)試培養(yǎng)基表面劃平行直線(xiàn)，可同時(shí)在一個(gè)平板上接種多個(gè)菌株，但劃線(xiàn)不能交叉，然后按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

評(píng)價(jià)方法：培養(yǎng)后按以下方法進(jìn)行平板生長(zhǎng)評(píng)估：0表示無(wú)生長(zhǎng)， 1表示生長(zhǎng)，2表示良好生長(zhǎng)。目標(biāo)菌得分應(yīng)為2,并且有典型的菌落外觀(guān)、大小和形態(tài)。非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)應(yīng)該部分或全部被抑制。

2、液體培養(yǎng)基

為確定液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率，應(yīng)接種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物。下面介紹的是用定量、半定量和定性方法評(píng)估生長(zhǎng)率和選擇性的方法。所推薦的這些方法都是通過(guò)將液體培養(yǎng)基以?xún)A注或劃線(xiàn)方式接種到瓊脂平板上培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)或計(jì)算液體培養(yǎng)基分?jǐn)?shù)而得出其生長(zhǎng)數(shù)量的。對(duì)于液體培養(yǎng)基定性測(cè)試方法，則通過(guò)肉眼觀(guān)察來(lái)實(shí)現(xiàn)。

目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的定量稀釋法步驟如下：選擇液體培養(yǎng)基10mL/管待檢。

接種目標(biāo)菌：將少量測(cè)試菌株培養(yǎng)物(每管10CFU~100CFU)接種測(cè)試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯，混勻。

接種非目標(biāo)菌：將大量測(cè)試菌株培養(yǎng)物(每管大于1000CFU)接種測(cè)試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯，混勻。

接種目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的混合培養(yǎng)物：用少量目標(biāo)菌(每管10CFU ~100CFU)測(cè)試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯。同時(shí)每管接種大量非目標(biāo)菌(每管大于1000CFU),混勻。

稀釋劑和運(yùn)輸培養(yǎng)基中目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的接種：接種測(cè)試菌于稀釋劑中(每管100CFU~1000CFU),混勻。

按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

結(jié)果的計(jì)算和解釋?zhuān)?/span>

(1)計(jì)算目標(biāo)和非目標(biāo)微生物的菌落數(shù)，用生長(zhǎng)率(PR)和選擇因子(SF)進(jìn)行結(jié)果的解釋。

目標(biāo)微生物的PR不應(yīng)小于0.1 (因生長(zhǎng)的不同不能超過(guò)1個(gè)數(shù)值).

非目標(biāo)微生物的SF至少應(yīng)達(dá)到2。

SF的計(jì)算見(jiàn)式 : SF=Do-Ds

式中：

Do-在參考培養(yǎng)基上能生長(zhǎng)至少10個(gè)菌落的稀釋度；

Ds-在測(cè)試培養(yǎng)基上顯示相應(yīng)生長(zhǎng)的稀釋度；

SF、Do和Ds用Ig表示。

例如：Do=lg104=4.0, Ds=lg103=3.0,選擇因子SF=1.0。

混合菌株中， 目標(biāo)菌的生長(zhǎng)不應(yīng)受到非目標(biāo)菌的抑制，即目標(biāo)菌始終應(yīng)為優(yōu)勢(shì)菌群。

(2)在混合菌株中目標(biāo)菌數(shù)量的值及非目標(biāo)菌數(shù)量的值應(yīng)符合以下要求：目標(biāo)菌的濃度應(yīng)達(dá)到10CFU/mL ~100CFU/mL;在選擇性肉湯培養(yǎng)物中非目標(biāo)菌的濃度不應(yīng)超過(guò)104CFU/mL。

(3)稀釋和運(yùn)輸培養(yǎng)基不應(yīng)引起目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌數(shù)量的減少或增加。菌株在這些培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的數(shù)量變化應(yīng)在最初計(jì)數(shù)的±50%的范圍內(nèi)。

四、培養(yǎng)基的保存

為防止培養(yǎng)基變干燥、變質(zhì)和污染，培養(yǎng)基應(yīng)存放在冷暗處或4℃冰箱中，并標(biāo)明名稱(chēng)、配制日期等。

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