細胞計數儀在單細胞測序中的應用

來源：瑞孚迪生命科學

作者：王多魚

單細胞測序

單細胞測序是指在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組、表觀組等遺傳信息進行高通量測序分析的一項技術。它能夠揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質性，在腫瘤、發(fā)育生物學、微生物學、神經科學等領域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學研究的焦點。與傳統(tǒng)的測序技術相比，單細胞測序不僅測量基因表達水平更加精確，而且還能檢測到微量的基因表達子或罕見非編碼RNA，其優(yōu)勢是多層次的。

如何實現單細胞測序
單細胞測序流程包括：單細胞的分離制備、遺傳物質的提取擴增以及遺傳物質的高通量測序。(圖1)

圖1.單細胞轉錄組流程

細胞計數儀在單細胞測序中的應用
在整個流程中高質量的單細胞（核）懸液是實驗成功的基礎，無論起始樣本如何，良好的細胞（核）狀態(tài)對于有效的細胞捕獲和后續(xù)進一步研究都至關重要。大多數情況下，研究者會選用新鮮離體的樣本制備成單細胞懸液，但是有些樣本并不適用，需要進行細胞核抽提制備成細胞核懸液。（例如心臟、肌肉、脂肪等樣本由于細胞直徑過大，無法被機器捕獲。由于有些細胞相對脆弱，單細胞懸液制備過程中會破裂影響實驗結果，比如肝臟細胞。神經細胞比較敏感，樣本消化過程中會改變某些基因的表達等。）兩種方法各有優(yōu)缺點，根據具體樣本和實驗選擇。

對于得到的單細胞或細胞核樣本需要進行質控來確保樣本的質量，以10xGenomics單細胞測序平臺為例，對于單細胞懸液要求：細胞總量>5x105cells、細胞濃度1x103cells/μl、細胞直徑5-30μm、細胞活率>70%、無細胞碎片或其他顆粒物，對于單細胞核懸液要求：細胞活性<5%、盡量無碎片和細胞團、細胞核形態(tài)完整。由于單細胞測序樣本制備后需要在較短的時間內完成后續(xù)遺傳物質提取，所以需要進行快速準確的計數。對于這些質控需求我們通過Cellometer系列細胞計數儀即可完成。目前市場上的自動細胞計數儀主要有兩種計數方法：基于臺盼藍染色的明場細胞計數和基于AO/PI/DAPI的熒光計數方法，經過大量的實驗發(fā)現，臺盼藍染色有兩個問題。首先，原代細胞樣品中含有紅細胞、血小板和細胞碎片，在未經純化的樣本中會嚴重的影響計數結果（圖2a），其次，臺盼藍染色會影響不健康的細胞和死亡的細胞，從而低估死亡細胞的數量和活力（圖2b）。

圖2.使用臺盼藍進行明場細胞計數。（左）樣品中有大量非特異性顆粒，難以將PBMC與紅細胞和血小板進行區(qū)分。（右）臺盼藍影響死細胞的形態(tài)，形成深色的擴撒輪廓。

Cellometer系列細胞計數儀不僅支持臺盼藍染色方法，同時支持AO/PI染色方法，采用吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）雙熒光混合染料，分別對活細胞和死細胞的細胞核進行染色并自動計數，可以有效避免臺盼藍染色方法中的問題。在單細測序中，大部分都是原代細胞樣品或者需要進行細胞核抽提的樣本，需要對細胞核進行染色并計數來確定樣品制備情況。Cellometer系列細胞計數儀可以通過AO/PI染色對原代或者脆弱的細胞樣本（如全血、PBMCs、肝細胞和小鼠脾細胞等）中的有核細胞進行精準的識別計數，其中非有核物體（如紅細胞、血小板或碎片等）被排除在外。（圖3）

圖3. 不同種類細胞計數

細胞的形態(tài)多種多樣，大小各不相同，因此對細胞計數來說，能夠識別和分割不同的細胞類型和形態(tài)至關重要。Cellometer軟件具有的勾勒細胞輪廓的精確算法，精準識別和計數直徑從3-300μm的細胞。對于單細胞測序，為了防止微流控裝置堵塞，需要將上機樣品制備成單細胞懸液，不能有細胞團塊。Cellometer軟件可以確定單細胞和細胞團的數量，以確保細胞樣品可以進行單細胞測序。（圖4）

圖4.單細胞和細胞團塊計數

Cellometer軟件中內置了幾百種默認細胞庫，滿足大部分細胞計數要求，同時對于特定的細胞類型和計數要求，軟件中具有多種參數可以定制化調節(jié)。在單細胞測序中，單細胞核懸液中的細胞核的數量可以通過PI染色進行定量。（圖5）另外Cellometer K2細胞計數儀支持GMP/GLP或21CFR，為實驗數據提供安全保證。

圖5.單細胞核計數

Cellometer K2配有Matrix圖像識別軟件，利用明場和雙熒光成像，可快速準確地識別單個細胞并計數。軟件會自動計算和顯示細胞數、濃度、直徑和存活率%。

Cellometer K2具有以下優(yōu)點：

雙熒光和明場成像 – 只對有核細胞進行染色，可獲得最準確的細胞計數和存活率%

快速獲得結果 – 60秒內即可完成對細胞數、大小和濃度以及存活率%的計算

分析復雜樣本 – 可分析多種復雜樣本，包括全血、外周血、臍帶血、骨髓等

多視野 – 準確度更高，針對每個樣本，可捕獲一個、四個或八個圖像

預設實驗 – 可快速分析細胞存活率%、細胞凋亡和轉染效率

預設細胞類型 – 已保存的參數涵蓋400多種細胞類型

樣本體積小 – 僅需10μl的細胞樣本

可自定義報告 – 可以根據需求設計報告內容，包括創(chuàng)建曲線圖、圖片、圖表和表格等內容

支持多種語言 – 支持7000多種語言

符合21 CFR Part 11要求 – 多種附加功能可供選擇，包括審計追蹤、用戶分級管理、電子簽名