聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）關(guān)鍵要素詳解

 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一個強大的分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴增特定的DNA片段。PCR反應(yīng)指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴增增強因子，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。PCR反應(yīng)將微量目的DNA片段擴增一百萬以上，它以敏感度高，特異強，產(chǎn)率高，重復(fù)好，以快速簡便優(yōu)點迅速成分子生物學(xué)研究中最為廣泛的方法。

PCR反應(yīng)的成功依賴于五個關(guān)鍵要素：

1. 引物：

1) 引物是一段短的DNA序列，用于與目標(biāo)DNA模板的特定區(qū)域配對。

2) 設(shè)計原則包括長度（1530 bp）、G+C含量（40%60%）、避免二級結(jié)構(gòu)和引物間互補等。

3) 通常每條引物的濃度為0.10.5 μmol/L，過高可能導(dǎo)致非特異性擴增。

2. 模板DNA：

    是待擴增的DNA序列，可以是基因組DNA、cDNA或質(zhì)粒DNA。

    數(shù)量和純度對結(jié)果至關(guān)重要，通常使用102105拷貝，但過量可能增加非特異性產(chǎn)物。

    單鏈和雙鏈DNA均可作為模板，但線性DNA比環(huán)狀DNA擴增效果更好。

3. DNA聚合酶：

1) 負(fù)責(zé)催化DNA合成，常用的是Taq DNA聚合酶，因其耐高溫特性。

2) 其他如Pfu、Phusion等酶具有更高保真度，適用于特定應(yīng)用。

3) 酶的濃度通常為1.02.5 U/100 μL反應(yīng)液，過高或過低均影響擴增效率。

4. dNTPs（脫氧核苷三磷酸）：

1) 作為DNA合成的原料，通常等量加入反應(yīng)體系，終濃度為20200 μmol/L。

2) 濃度過高可能抑制Taq酶活性，影響產(chǎn)物特異性。

5. Mg2+：

1) 作為DNA聚合酶的輔助因子，影響酶活性和產(chǎn)物特異性。

2) 終濃度通常為0.52.5 mmol/L，需要根據(jù)引物Tm值和dNTP濃度調(diào)整。

此外，PCR反應(yīng)還需要緩沖液提供適宜的pH和離子環(huán)境，以及適當(dāng)?shù)臏囟瓤刂疲ㄗ冃?、退火、延伸三個階段）來完成循環(huán)擴增。