Attune Xenith流式細胞儀25色光譜流式方案深度解析NK細胞表型及功能-賽默飛

近年來隨著光譜流式細胞儀的發(fā)展，大大擴展了流式細胞術(shù)的分析維度，使得流式實驗可同時檢測20+參數(shù)，為免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物研發(fā)等生命科學(xué)領(lǐng)域的研究工作提供一個高效、得力的工具。

本文主要介紹了一個專門用于研究自然殺傷(NK)細胞的25色光譜流式實驗方案。NK細胞是一類負責(zé)通過識別特定標(biāo)志物或其缺失來識別并清除受感染或癌變細胞的免疫細胞亞群（圖1）。本研究旨在探究與NK細胞活化、抑制及成熟相關(guān)的多種標(biāo)志物。該光譜實驗方案共包含 25 種標(biāo)志物，并專為 Attune Xenith 全光譜流式細胞儀優(yōu)化設(shè)計，可實現(xiàn)對大量細胞的高速分析。下文中我們總結(jié)了該多色方案的實驗設(shè)計、所選標(biāo)志物及其在NK細胞研究中的重要性。

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圖1. NK細胞通過識別特定細胞標(biāo)志物的存在與否作出相應(yīng)反應(yīng)

Attune Xenith 25色光譜流式實驗方案

Attune Xenith 25色光譜流式實驗步驟

一、 試劑準(zhǔn)備

1. LIVE/DEAD 工作液：

a. 按照說明書制備 LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 染料。

b. 取 1 µL LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 溶液加到 49 µL 1× PBS 中制備工作液，輕輕上下吹打混勻。

2. 按照說明書制備細胞因子分裝液，儲存于 -80 ℃ 備用。

a. 加入所選培養(yǎng)基的終濃度將為100 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-15 和 25 ng/mL IL-21。

3. 將 AIM-V 培養(yǎng)基放在 37 ℃ 水浴鍋中預(yù)熱。

4. 如需進行細胞刺激：

a. 制備含 5% 熱滅活 FBS 和 100 U/mL 青霉素-鏈霉素雙抗的 NK-Xpander 培養(yǎng)基。

b. 放在 37 ℃ 水浴鍋中預(yù)熱。

二、PBMC復(fù)蘇

1. 將密封良好的凍存 PBMC 凍存管置于 37 ℃ 水浴中約 90 秒，隨后每隔 15-20 秒輕輕顛倒混勻 3-4 次，直至瓶內(nèi)約 75% 內(nèi)容物呈液態(tài)。

2. 從水浴鍋中取出 PBMC 凍存管，擦凈管外壁殘留的水分。

3. 對于每管凍存的PBMC（體積約 1 mL，含約 5×10? 個細胞）：

a. 將 PBMC 輕輕倒入 50 mL 離心管中，加入 10 mL 預(yù)熱的 AIM-V 培養(yǎng)基。

b. 再向每個 PBMC 瓶中緩慢加入 2 mL AIM-V 培養(yǎng)基，倒入第 3a 步中使用的同一支 50 mL 離心管中，并重復(fù)一次。

c. 400×g 離心 5 分鐘，輕輕棄去上清液。

d. 用1× PBS重懸 PBMC，并輕輕上下吹打混勻（根據(jù)所需細胞濃度，使用 1 ~10 mL 任意體積的 PBS 重懸細胞）。

e. 輕輕顛倒混勻細胞懸液數(shù)次，使用 Countess 3 自動細胞計數(shù)儀記錄細胞濃度及存活率。

注：若細胞存活率低于90%，建議另取一管新的 PBMC，重新制備細胞樣本。

三、細胞刺激

1. 分裝細胞刺激用的細胞懸液。

a. 將適量體積的細胞懸液分裝至各離心管中，建議細胞刺激時使用至少 9×10? 個活細胞。

b. 400×g 離心 5 分鐘，輕輕棄去上清液。

c. 將各刺激管中的細胞重懸于 NK-Xpander 培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至 3×10? 個活細胞/mL。

d. 將陰性對照（未刺激）管中的細胞重懸于 1× PBS 中，調(diào)整濃度至 1×10? 個活細胞/mL，直接進行細胞染色步驟。

2. 向待刺激細胞懸液中加入 IL-2 至終濃度 100 U/mL、IL-15 至 10 ng/mL 以及 IL-21 至 25 ng/mL。

3. 分裝至 6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔的最小體積為 1 mL。

4. 37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 48 小時

a. 48 小時后，將細胞懸液從培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至離心管中，吹打數(shù)次混勻。

b. 輕輕顛倒混勻細胞懸液管數(shù)次，使用 Countess 3 自動細胞計數(shù)儀記錄濃度及存活率。

四、細胞染色

1. 用1× PBS重懸PBMC，調(diào)整細胞濃度為 1×10? 個活細胞/mL。

2. 輕輕顛倒混勻細胞懸液管數(shù)次，用70 μm 細胞濾器過濾至新的 50 mL 離心管中。

3. 制備熱激處理的細胞作為細胞活性染料單染對照：

a. 將 1 mL細胞懸液（1×10? 個細胞）加入微量離心管中，置于加熱塊上，于 65 ℃ 孵育 5 分鐘。從加熱塊上取下，冰上放置 2–3 分鐘。

b. 向熱塊孵育后的冷卻微量離心管中加入 500 μL 新鮮制備的PBMC懸液。

4. 分出足量的 PBMC 用于未染色和單染管對照（不加入細胞活性染料）。

5. 向剩余的PBMC懸液中每 1 mL PBMC 加入 1 μL L/D死活染料工作液，輕輕吹打數(shù)次混勻。

6. 將所有細胞懸液 4 ℃ 避光孵育 30 分鐘。

7. 4 ℃  400×g 離心 5 分鐘，棄上清，并用吸水紙短暫接觸吸除殘留液體。

8. 用eBioscience 流式染色緩沖液重新細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為 1×10? 個/mL，輕輕吹打混勻。

9. 每 10? 個細胞（即 100 μL 重懸液）懸液中，加入 20 μL 人 BD Fc Block™、10 μL Brilliant stain buffer和 5 μL CellBlox Plus blocking buffer進行封閉處理,輕輕渦旋混勻。

10.  4 ℃避光孵育 15 分鐘。

11. 將 100 μL 封閉后的細胞懸液分別轉(zhuǎn)移至各流式管中備用。

a. 樣本為經(jīng) LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 染料染色的批量 PBMC 細胞。

b. 細胞活性單染對照使用熱激處理過的染色細胞懸液。

c. 未染色及所有其他單染細胞對照使用未染色的細胞懸液。

12. 向樣品管和對照管中加入相應(yīng)的適量抗體，輕輕渦旋混勻。

13. 4 ℃ 避光孵育 30 分鐘。

14. 加入 1 mL eBioscience 流式染色緩沖液洗滌樣本。

15. 4 ℃ 400×g 離心 5 分鐘，棄上清，并用吸水紙短暫接觸以吸除殘留液體。

16. 將細胞沉淀重懸于 1 mL eBioscience 流式染色緩沖液中，輕輕吹打混勻。

17.  4 ℃ 400×g 離心 5 分鐘，棄上清，用吸水紙短暫接觸以吸除殘留液體。

18. 將細胞沉淀重懸于 200 μL eBioscience 流式染色緩沖液中，輕輕吹打混勻。

19. 立即上機分析或使用 eBioscience 細胞固定液進行細胞固定。

注：LIVE/DEAD 可固定細胞活性染料可用于新鮮樣本，并且在多種固定劑中都能保持穩(wěn)定。若使用其他細胞活性染料，需在實驗前進行測試，確保固定前后死細胞的染色效果一致。

五、實驗對照

1. 按照說明書制備 UltraComp eBeads Plus 補償微球。

2. 使用 eBioscience 細胞固定液進行微球固定或立即上機分析。

注：微球?qū)φ盏奶幚矸绞綉?yīng)與染色的細胞對照一致。如果對照管和樣本管細胞進行了固定和/或破膜處理，則需對微球?qū)φ者M行相同的處理流程。

Attune Xenith 25色光譜流式實驗結(jié)果

圖2. 25色自然殺傷細胞流式方案的設(shè)門策略。采用25色流式實驗方案分析NK細胞。首先圈出活的淋巴細胞，依次設(shè)門排除雙聯(lián)體、死細胞和非NK細胞。最后分析門內(nèi)具有特定表面標(biāo)志物的NK細胞。每種顏色對應(yīng)多色方案中使用的不同熒光標(biāo)記抗體，從而對NK細胞亞群進行精確鑒定與分析。

圖3. 泛NK細胞標(biāo)志物。不同自然殺傷細胞亞群中 NKp30、NKp46、CD226 和 CD244 的表達情況。

圖4. 細胞刺激后泛 NK 細胞標(biāo)志物的表達變化。當(dāng)NK細胞用 100 IU/mL  IL-2、10 ng/mL  IL-15 以及 25 ng/mL  IL-21 刺激過夜后，CD11b 或 CD161 的表達水平會發(fā)生變化。

圖5. NK細胞亞群中的活化標(biāo)志物。成熟NK細胞群體中表達不同水平的成熟抗原。在病毒感染或腫瘤細胞的刺激過程中，可追蹤 NKG2C、CD2 和 CD38 等標(biāo)志物的表達變化情況。

圖6. NK細胞亞群中的抑制性抗原。NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2/3 和 KLRG1 的表達水平如圖所示，這些分子在響應(yīng)腫瘤和病毒感染時調(diào)控NK細胞的活化與功能。

圖7. NK細胞中活化抗原的表達。當(dāng)PBMC受到刺激后，NK細胞多種活化標(biāo)志物的表達水平不盡相同，如 TIGIT、CD69 和 NKp46 。未成熟、成熟及終末NK細胞的表達水平可能存在差異。

圖8. 使用25色NK細胞實驗方案準(zhǔn)確檢測稀有細胞亞群。使用Attune Xenith快速采集超過 100 萬個細胞 (流速：200 µL/分鐘)，用于分析未成熟、成熟及終末NK細胞亞群。第一個圖展示了這些細胞亞群占細胞總數(shù)的百分比。

光譜流式細胞術(shù)討論

光譜流式細胞術(shù)大大擴展了流式實驗可同時檢測的參數(shù)數(shù)量，從而可以更深入地研究目標(biāo)細胞群體。本實驗中我們采用 25 色流式方案對人PBMC中的各種NK細胞亞群進行深入分析。通過分析未成熟、成熟及終末 NK 細胞亞群中關(guān)鍵標(biāo)志物的表達水平，以闡明 NK 細胞活化與抑制狀態(tài)的表型特征。采用多種標(biāo)志物標(biāo)記經(jīng)細胞因子刺激和未刺激的人 PBMC，結(jié)果顯示刺激后 NK 細胞亞群的活化指標(biāo)水平發(fā)生顯著變化，包括 CD69、NKp46 等在內(nèi)的多個重要標(biāo)志物的表達水平與 NK 細胞在此類刺激條件下的預(yù)期相符。這有效證實了 Attune Xenith全光譜流式細胞儀及應(yīng)用的多色流式方案能夠精確研究腫瘤免疫中這一重要免疫細胞譜系的能力。

Sasquatch 軟件工具和光譜解析結(jié)果表明，該多色方案尚未充分發(fā)揮Attune Xenith系統(tǒng)的檢測潛力。隨著光譜流式方案的不斷發(fā)展，后續(xù)研究可以更深入地探索 PBMC 樣本中非 NK 細胞的表型特征，以及增加NK 細胞亞群中其他活化/抑制標(biāo)志物。這一持續(xù)改進將進一步提升該多色實驗方案在更全面研究免疫細胞亞群方面的實用性。

Attune Xenith 全光譜流式細胞儀

Invitrogen™ Attune™ Xenith™是賽默飛全新推出的一款快速且抗堵的全光譜流式細胞儀，將聲波聚焦技術(shù)與全光譜解析功能結(jié)合，旨在為前沿的科學(xué)研究提供一種高效、靈敏、可靠的解決方案。

其主要技術(shù)優(yōu)勢為：

· 全光譜：配置高達6激光57參數(shù)

· 速度快：上樣速度比其他光譜流式儀快5倍

· 抗堵：專業(yè)抗堵塞設(shè)計

· 靈敏：尤其適合稀有細胞檢測

· 自動化：配套流式自動化工作站

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