優(yōu)化流式細(xì)胞分析的關(guān)鍵——FcR阻斷劑

Fc Receptor

流式細(xì)胞術(shù)通過熒光標(biāo)記抗體特異性的識別細(xì)胞或細(xì)胞亞群，從而在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測和區(qū)分。標(biāo)記抗體的Fab段進(jìn)行特異性識別，但所有抗體中高度保守區(qū)Fc段也會被部分細(xì)胞識別，識別免疫球蛋白（Ig）Fc段的蛋白即為Fc受體（Fc Receptor）。

Fc受體存在于多種免疫細(xì)胞的表面，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、髓系細(xì)胞、B細(xì)胞表面、NK細(xì)胞等等，在免疫細(xì)胞表面發(fā)揮多種關(guān)鍵功能：

吞噬作用：免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞通過Fc受體識別并吞噬被抗體包被的微生物，這是一種重要的先天免疫防御機(jī)制。

溶酶體降解：吞噬后的免疫復(fù)合物被運輸?shù)饺苊阁w內(nèi)，溶酶體中的酶類能夠降解病原體和其他異物，完成病原體的清除過程。

細(xì)胞毒作用：自然殺傷細(xì)胞等通過Fc受體識別被抗體標(biāo)記的細(xì)胞，釋放細(xì)胞毒性顆粒。

細(xì)胞因子和趨化因子的分泌：激活的免疫細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子和趨化因子，有助于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，吸引其他免疫細(xì)胞到感染或炎癥部位。

圖1 免疫細(xì)胞表面FC受體的功能

FcR根據(jù)它們結(jié)合的免疫球蛋白類型被分為不同的類別：IgG的Fc受體（FcγR）、IgE的Fc受體（FcεR、IgA的Fc受體（FcαR）、IgM的Fc受體（FcμR）和IgD的Fc受體（FcδR）。

日常實驗中使用的多是IgG類型的單抗，其Fc受體（FcγR）根據(jù)親和力強(qiáng)弱可分為三個亞家族：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。

圖2 FcγR 家族和表達(dá)模式

FcR阻斷

在流式實驗中細(xì)胞表面表達(dá)的多種FcγR易與抗體FC段結(jié)合，出而出現(xiàn)非特異性染色，導(dǎo)致分析中容易出現(xiàn)高背景或甚至假陽性信號。為獲得正確的陽性細(xì)胞群，可以先加入封閉試劑孵育細(xì)胞，占據(jù)結(jié)合位點阻斷Fc受體與抗體結(jié)合，降低檢測背景獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。

常見的封閉試劑主要有以下幾種：

血清或血清隨純化的IgG

抗CD16/32抗體

抗CD16/32抗體

S-RMab®FcR阻斷劑

斯達(dá)特上新Human FcR Blocking Reagent，親和力強(qiáng)，聯(lián)同已上新的Mouse Fc Receptor Blocker，提供FcR阻斷產(chǎn)品。

產(chǎn)品名稱：Human FcR Blocking Reagent           貨號：S0F0002           阻斷用量：1.0μg per 2.5x10^5 cells in 100ul volume

流式分析人PBMC標(biāo)記兔單克隆IgG同型對照抗體，孵育30分鐘后在冰上PBS（右側(cè)）與Human FcR Blocking Reagent按1/100（1 µg，2.5×10^5細(xì)胞在100 µL中）稀釋度處理以阻斷Fc受體及非特異性蛋白結(jié)合，并與未標(biāo)記對照組（未與一抗和二抗孵育的細(xì)胞）（藍(lán)色）進(jìn)行比較。

流式細(xì)胞術(shù)分析THP-1細(xì)胞標(biāo)記兔單克隆IgG同型對照抗體，在冰上PBS（黑色）或人類FcR阻斷試劑按1/100稀釋度（1 µg，2.5×10^5細(xì)胞在100 µL中）（紅色）孵育30分鐘處理，以阻斷Fc受體及非特異性蛋白結(jié)合，并與未標(biāo)記對照組（未與一抗和二抗孵育的細(xì)胞）（藍(lán)色）進(jìn)行比較。