標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué) Q＆A

Q1：什么是標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)？

A1：標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)是通過(guò)化學(xué)或同位素標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行標(biāo)記，從而在質(zhì)譜分析中區(qū)分不同樣本，實(shí)現(xiàn)相對(duì)或絕對(duì)定量的技術(shù)。常見(jiàn)方法包括iTRAQ、TMT和SILAC 。

Q2：基于SILAC、iTRAQ/TMT 的蛋白定量有什么區(qū)別？

A2：

SILAC：是一種在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用的代謝標(biāo)記方法，通常支持 2-3 重（使用 NeuCode 最多可支持 4 重以上）。定量在一級(jí)質(zhì)譜 (MS1) 水平進(jìn)行。

iTRAQ：是一種化學(xué)同位素標(biāo)記方法，支持 4-8 重。定量在二級(jí)質(zhì)譜 (MS2) 水平進(jìn)行。

TMT：也是一種同位素化學(xué)標(biāo)記技術(shù)，支持 10-18 重，適用于大規(guī)模、高通量研究。定量在二級(jí)質(zhì)譜 (MS2) 水平進(jìn)行。

Q3：與非標(biāo)記方法相比，基于標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)有哪些優(yōu)勢(shì)？

A3：基于標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)由于所有樣品同時(shí)混合和分析，因此定量準(zhǔn)確度更高，樣品間的重現(xiàn)性也更好。它還能減少因單獨(dú)運(yùn)行而造成的技術(shù)差異，并支持多重分析，允許在單次質(zhì)譜分析中比較多個(gè)樣品。

Q4：如何選擇合適的標(biāo)記定量方法？

A4：這取決于您的樣本類(lèi)型、實(shí)驗(yàn)規(guī)模和研究目標(biāo)。

1、如果您使用的是活細(xì)胞，并且需要在細(xì)胞水平上進(jìn)行精確定量，請(qǐng)使用 SILAC。該方法非常適合動(dòng)態(tài)研究，例如時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)或治療反應(yīng)，因?yàn)闃?biāo)記發(fā)生在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中。

2、iTRAQ 適用于組織或體液樣本，可為中等通量研究提供良好的靈敏度和可重復(fù)性。

3、TMT 也適用于組織和體液樣本，是高通量研究的shǒu xuǎn，每次運(yùn)行最多可進(jìn)行 18 個(gè)樣本的多重分析。

還需要考慮儀器兼容性、所需的多重分析水平和預(yù)算等因素。

Q5：iTRAQ/TMT定量中為何采用 MS2 而不是 MS1 進(jìn)行 reporter 離子定量？

A5：在iTRAQ和TMT實(shí)驗(yàn)中，所有標(biāo)記肽段都是同量異位素的——它們?cè)贛S1水平上具有相同的質(zhì)量數(shù)，并且在色譜分析過(guò)程中會(huì)共流出。因此，在MS1掃描中無(wú)法區(qū)分它們。在MS2碎裂后，每個(gè)標(biāo)記肽段都會(huì)釋放出具有不同m/z的dú tè報(bào)告離子，因此可以根據(jù)這些報(bào)告離子的強(qiáng)度對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行精確定量。

Q6：標(biāo)記定量能否用于絕對(duì)定量？

A6：是的，基于標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)可以用于絕對(duì)定量，但需要使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)肽段或蛋白質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。在該方法中，通過(guò)加入已知濃度的合成肽段或蛋白質(zhì)來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)將報(bào)告離子的強(qiáng)度（在 iTRAQ/TMT 中）或 MS1 峰強(qiáng)度（在 SILAC 中）與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，研究人員可以計(jì)算出樣品中目標(biāo)蛋白的絕對(duì)濃度。然而，這種方法比相對(duì)定量更復(fù)雜，因?yàn)樗婕邦~外的校準(zhǔn)步驟，通常用于需要精確定量蛋白質(zhì)含量的情況。

Q7：哪些樣本可以在同一批TMT或iTRAQ實(shí)驗(yàn)中混合分析？

A7：建議將來(lái)源一致、處理?xiàng)l件明確且具有可比性的樣本安排在同一TMT或iTRAQ批次中，例如同種細(xì)胞或組織在“對(duì)照 vs 藥物處理”條件下的比較。不同組織（如肝臟、腦組織、肌肉等）蛋白組成和復(fù)雜度差異顯著，混合標(biāo)記可能導(dǎo)致高豐度蛋白掩蓋低豐度信號(hào)，降低鑒定通量和定量準(zhǔn)確性。此外，應(yīng)避免將不同批次采集或處理的樣本放入同一標(biāo)記組，以減少技術(shù)誤差干擾?？傊?，TMT/iTRAQ實(shí)驗(yàn)應(yīng)最大限度保持樣本在生物背景和實(shí)驗(yàn)條件上的一致性，以確保數(shù)據(jù)的科學(xué)性和可比性。

Q8：不同組織間TMT信號(hào)偏移是否可以通過(guò)數(shù)據(jù)歸一化處理解決？

A8：部分偏差可以通過(guò)總強(qiáng)度歸一化、中位數(shù)校正等方法進(jìn)行技術(shù)層面的調(diào)整，但如果生物本底差異過(guò)大，歸一化往往會(huì)掩蓋真實(shí)差異或放大假陽(yáng)性。因此，數(shù)據(jù)預(yù)處理不能替代科學(xué)的實(shí)驗(yàn)分組。

Q9：利用SILAC穩(wěn)定同位素標(biāo)記細(xì)胞后，多長(zhǎng)時(shí)間可以提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜鑒定？

A9：SILAC為體內(nèi)標(biāo)記，其隨著細(xì)胞增殖對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記，通常需要連續(xù)傳代至少5–6代（population doublings），確保細(xì)胞內(nèi)的天然氨基酸（如Lys、Arg）被同位素標(biāo)記的氨基酸wán quán替代。具體時(shí)間因細(xì)胞類(lèi)型而異。標(biāo)記是否wán quán，可以通過(guò)質(zhì)譜預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)記效率，標(biāo)記率需 ≥95% 才適合進(jìn)行正式的SILAC質(zhì)譜分析。

Q10：TMT實(shí)驗(yàn)中，如何評(píng)估樣本之間的混合是否均一？

A10：可在標(biāo)記前后分別取少量樣本進(jìn)行SDS-PAGE定量比對(duì)，標(biāo)記后也可在MS中查看各reporter離子強(qiáng)度是否大致均衡，若偏差大需重新標(biāo)記或混合。

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