黃曲霉的檢驗(yàn)檢疫要求與方法及檢測(cè)方法的分析！

黃曲霉，半知菌類，一種常見(jiàn)腐生真菌。多見(jiàn)于發(fā)霉的糧食、糧制品及其它霉腐的有機(jī)物上。菌落生長(zhǎng)較快，結(jié)構(gòu)疏松，表面灰綠色，背面無(wú)色或略呈褐色。菌體有許多復(fù)雜的分枝菌絲構(gòu)成。營(yíng)養(yǎng)菌絲具有分隔；氣生菌絲的一部分形成長(zhǎng)而粗糙的分生孢子梗，頂端產(chǎn)生燒瓶形或近球形頂囊，表面產(chǎn)生許多小梗（一般為雙層），小梗上著生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、頂囊、小梗和分生孢子合成孢子頭，可用于產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是釀造工業(yè)中的常見(jiàn)菌種。

一、檢驗(yàn)檢疫要求

1995年，世界衛(wèi)生組織制定的食品允許濃度為15ug/kg。

美國(guó)聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定人類消費(fèi)食品和奶牛飼料中的黃曲霉毒含量（指b1+b2+g1+g2的總量）不能超過(guò)15ug/kg.人類消費(fèi)的牛奶中的含量不能超過(guò)0.5ug/kg,其他動(dòng)物飼料中的含量不能300ug/kg。

而歐盟國(guó)家規(guī)定更加嚴(yán)格，要求人類生活消費(fèi)品中的b1的含量不能超過(guò)0.05ug/kg。

二、檢驗(yàn)檢疫方法

1、薄層層析

薄層層析（thin-layer chromatography,tlc)是在研究方面應(yīng)用的分離技術(shù).自1990年，它被列為aoac (association of official agricultural chemists)標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法同時(shí)具有定性和定量分析的功能。

2、液相色譜

液相色譜（liquid chromatography,lc)與薄層層析在許多方面具有相似性，二者互相補(bǔ)充.通常用tlc進(jìn)行前期的條件設(shè)定，選擇適宜的分離條件后，再用lc進(jìn)行的定量測(cè)定。

3、免疫化學(xué)分析

利用具有高度專一性的單克隆抗體或多克隆抗體設(shè)計(jì)的的免疫分析方法，也是的檢測(cè)方法.這類方法通常包括放射免疫分析方法（radioimmunoassay,ria),酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked of immunosorbent assay,elisa)和免疫層析法（immunoaflinity column assay,ica).它們均可以對(duì)進(jìn)行定量測(cè)定。

(1)免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和術(shù)-hplc法

免疫親和柱法和酶聯(lián)免疫吸附法雖然都可達(dá)到速簡(jiǎn)便效果，但酶聯(lián)免疫吸附法僅能檢測(cè)單一毒素（如b1)含量，而且易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，難以控制.免疫親和柱法（包括熒光光度法和hplc法）卻能達(dá)到既定量準(zhǔn)確又快速簡(jiǎn)便的要求。

免疫親和柱的使用可以避免傳統(tǒng)tlc和hplc的缺點(diǎn)，同時(shí)免疫親和柱與tlc和hplc法結(jié)合可以大大提高工作效率，提高靈敏度和準(zhǔn)確度。

免疫親和柱-熒光光度計(jì)法是以單克隆免疫親和柱為分離手段，用熒光計(jì)，紫外燈作為檢測(cè)工具的快速分析方法.它克服了tlc和hplc法在操作過(guò)程中使用劇毒的真菌毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物和在樣品預(yù)處理過(guò)程中使用多種有毒，異味的有機(jī)溶劑，毒害操作人員和污染環(huán)境的缺點(diǎn).同時(shí)免疫親和柱-熒光光度計(jì)法分析速度快，一個(gè)樣品只需10-15min,比傳統(tǒng)方法快幾個(gè)小時(shí)甚至幾天時(shí)間；儀器設(shè)備輕便容易攜帶，自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，直接讀出測(cè)試結(jié)果，可以在小型實(shí)驗(yàn)或現(xiàn)場(chǎng)使用.可以進(jìn)行總量 (b1b2g1g2) 的測(cè)定，檢測(cè)限可達(dá)到1ug/kg,達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)值以下測(cè)定范圍為1-300ug/kg。

免疫親和柱-高效液相色譜法比傳統(tǒng)的hplc法更加安全，可靠，靈敏度和準(zhǔn)確度高.它采用單克隆抗體免疫技術(shù)，可以性地將或其他真菌毒素分離出來(lái)，分離效率和回收率高。

分析原理試樣中的用一定比例的甲醇/水提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾，稀釋后，用免疫親和柱凈化，以甲醇將親和柱上的淋洗下來(lái)，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度，然后用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量.也可以將甲醇-淋洗液的一部分注入hplc中，對(duì)b1,b2,g1,b2分別進(jìn)行定量分析.免疫親和柱是用大劑量的單克隆抗體固化在水不溶性的載體上，然后裝柱而成.該方法的測(cè)定范圍0-300ug/kg。

(2)酶聯(lián)免疫吸附法

1996年，nakane 建立了辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的測(cè)定技術(shù).由于該方法簡(jiǎn)便，敏感，特異，可作為多種抗原或抗體的測(cè)定，20世紀(jì)70年代后期，該方法引入真菌毒素的檢測(cè)中，下面介紹的是競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附間接法檢測(cè)b1。

原理：將已知抗原吸附在固態(tài)載體表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗體與待測(cè)樣品（含有抗原）提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)后，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物.洗除多余抗體成分，然后加入酶標(biāo)記的抗球蛋白的第二抗體結(jié)合物，與吸附在固體表面的抗原抗體結(jié)合物相結(jié)合，再加入酶底物.在酶的催化作用下，底物發(fā)生降解反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過(guò)酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)出酶底物的降解量，從而推知被測(cè)樣品中的抗原量。

(3)微柱篩選法

可以用來(lái)半定量測(cè)定各種食品中b1,b2,g1,g2的總量。

原理：樣品提取液中的被微柱管風(fēng)硅鎂型吸附層吸附后，在波長(zhǎng)365nm紫外光燈下顯示藍(lán)紫色熒光環(huán)，其熒光強(qiáng)度與在一定的光密度范圍內(nèi)成正比例關(guān)系.若硅鎂型吸附劑層未出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光，則樣品為陰性（方法靈敏度為5-10ug/kg).由于在微柱上不能分離b1,b2,g1,g2,所以測(cè)得結(jié)果為總的含量。

(4)一步式檢測(cè)金標(biāo)試紙法

一步式檢測(cè)金標(biāo)試紙法是利用單克隆抗體而設(shè)計(jì)的固相免疫分析法.由此產(chǎn)生的一步式快速檢測(cè)試紙可在5—10分鐘完成對(duì)樣品中的定性測(cè)定.借助標(biāo)準(zhǔn)樣品，這種方法能估算的含量，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和進(jìn)行大量樣品的初選。

三、檢測(cè)方法分析

薄膜層析法和液相色譜法是目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)都在使用的方法，由于其檢測(cè)周期長(zhǎng)，程序復(fù)雜，所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求.隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)，生物化學(xué)，分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速，簡(jiǎn)便，特異，敏感，低耗且適用的檢測(cè)方法.而且以金標(biāo)試紙為代表的這些方法已經(jīng)被國(guó)家所廣泛使用，引進(jìn)和消化這些的方法是我們檢測(cè)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急.免疫親和柱法優(yōu)點(diǎn)很多，但由于檢測(cè)費(fèi)用過(guò)高，而無(wú)法普及.而一步式檢測(cè)金標(biāo)試紙法似乎更適用于中國(guó)，值得推廣。

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