【應用】使用C-950雙模式高效分離蛋清蛋白

簡介

蛋白質在生物系統(tǒng)中起著至關重要的作用，參與生命所必需的各種代謝過程。由于它們的重要性，它們被廣泛應用于制藥等行業(yè)，在這些行業(yè)中，它們有助于藥物開發(fā)（例如抗生素和生物制藥），以及食品生產(chǎn)，在這些行業(yè)中，它們作為營養(yǎng)補充劑的關鍵成分。鑒于它們在健康相關應用中的預期用途，在蛋白質提取過程中實現(xiàn)高純度是至關重要的。

在各種可用的純化方法中，色譜法因其在分離蛋白質方面的有效性而經(jīng)常被采用。通常使用的技術包括離子交換，疏水相互作用，親和，反相和凝膠過濾色譜。反相色譜法已成為多肽和小蛋白質分離中最重要的工具。由于它的杰出分離能力，即使多肽只相差一個氨基酸殘基，也常常可以被分離。此外，反相色譜法使用水混合物作為流動相，因此該方法與含水樣品兼容。反相色譜法廣泛用于調查研究中的雜質檢測或治療藥物的大規(guī)模純化中去除不需要的化合物。由于反相色譜法使用極性有機溶劑作為流動相，因此該方法只能用于能夠承受嚴格條件的化合物。這種類型的色譜通常適用于肽和小的、穩(wěn)定的蛋白質，這些蛋白質在純化后會自發(fā)地重新折疊。

反相色譜法可作為Flash法或高效液相色譜法進行。這兩種技術經(jīng)常被使用，但目的不同：Flash色譜法主要用作純化前步驟，以足夠的分辨率純化大量樣品，而高效液相色譜法的目標是在較低上載量的條件下獲得最高的分辨率（純度）。因此這兩種技術的不同之處在于固定相所用的材料（不同的粒度）、色譜柱的尺寸（內徑和長度）和流動相的流速。

表1：Flash色譜與高效液相色譜的差異

蛋白質是復雜的分子，采用特定的三維結構，由氨基酸殘基和周圍溶劑之間的相互作用決定。這種結構折疊定義了它們的水動力半徑，它描述了它們在水溶液中的有效尺寸。在色譜法中，蛋白質穿透固定相孔隙的能力直接影響分離效率。色譜介質中較大的孔徑允許更好地進入固定相，提高蛋白質分離的分辨率。固定相的顆粒大小也會影響蛋白質與表面的相互作用。較小的顆粒提供更多的相互作用位點，導致更明顯的分離，而較大的顆粒限制了接觸面積，降低了分辨率。優(yōu)化孔隙和顆粒大小是實現(xiàn)高效蛋白質純化的必要條件。

蛋白質在色譜分離過程中的行為在很大程度上受其電荷的影響，這取決于溶劑的pH值。為了保持蛋白質的穩(wěn)定性，通常在緩沖溶液中進行純化，以保持其天然結構。在某些情況下，改變pH值是一種有效的策略，可以改變蛋白質的電荷，提高分離效率。

實驗設備

試劑和材料

實驗步驟

本研究的色譜圖是在以下實驗條件下生成的：

表3. 梯度1

表4. 梯度2

表5. 梯度3

先前的實驗表明，使用PrepPure C18WP （300 ?）柱，10 μm作為固定相，可以實現(xiàn)最佳的蛋白分離。圖1是樣品的色譜圖，使用PrepPure C18WP （300 ?）， 10 μm，在類似參考文獻的梯度下（梯度1：30%-90%，超過10分鐘）。與參考文獻不同，根據(jù)洗脫順序，只觀察到以下峰：卵泡樣蛋白、卵泡紅蛋白、溶菌酶、卵泡轉鐵蛋白和卵泡白蛋白。這些差異可歸因于用于樣品制備的雞蛋的質量和來源的差異。

為了完善分離條件，我們進行了多次實驗，以優(yōu)化目標蛋白的分辨率。圖2顯示了PrepPure C18WP （300 ?）， 10 μm，在梯度2：10%，20%和30%下獲得的色譜圖，這有利于目標蛋白的分離。

接下來，以 圖2 的實驗條件為參考，研究了孔徑和粒徑的影響。

圖3 為與 圖2 相同條件下的色譜圖，使用C18非WP （100 ?） （PrepPure C18, 10 μm）研究孔徑的影響。雖然紫外信號表明與C18WP相比，前兩個峰的分辨率提高了，但較低的吸光度和ELSD信號表明沒有發(fā)生有效的分離。C18WP的大孔徑（300 ?）使蛋白質能夠穿透顆粒并有效地與固定相相互作用。相比之下，PrepPure C18 （100 ?）， 10 μm無法實現(xiàn)分離，因為蛋白質只能與顆粒的外表面相互作用。這種有限的相互作用減少了吸附和解吸之間的平衡步驟的數(shù)量，從而影響了分離效率。

圖4和5 顯示了在與 圖2和圖3 相同的條件下（梯度3），使用Flash色譜柱：FlashPure Select C18 （100 ?）， 30 μm和EcoFlex C18 （100 ?）， 50 μm的色譜圖。當顆粒尺寸大于10 μm時，分離效果不明顯。表面相互作用的減少進一步限制了吸附和解吸之間的平衡步驟，使該梯度不足以有效分離。因此所有蛋白質以10%的梯度同時洗脫。此外，隨著顆粒大小的增加，更多的蛋白質在10%時共洗脫，減少了之前觀察到的30%的洗脫。

結論

參考文獻