KLF2通過抑制內(nèi)皮BMP/SMAD信號通路介導(dǎo)層流抗血管鈣化作用

KLF2 Mediates the Suppressive Effect of  Laminar Flow on Vascular Calcification by  Inhibiting Endothelial BMP/SMAD1/5 Signaling

Keywords: endothelial cells; vascular calcification.

血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化晚期常見的病理表現(xiàn)，尤其冠狀動(dòng)脈鈣化顯著增加心血管事件風(fēng)險(xiǎn)。臨床影像學(xué)分析顯示，鈣化灶優(yōu)先分布于血流紊亂的血管分叉或彎曲區(qū)域，提示血流動(dòng)力學(xué)異常可能驅(qū)動(dòng)鈣化進(jìn)程。內(nèi)皮細(xì)胞作為機(jī)械力感知的核心單元，可通過剪切應(yīng)力響應(yīng)調(diào)控血管穩(wěn)態(tài)，層流（LSS）誘導(dǎo)抗炎表型，而振蕩剪切力（OSS）促進(jìn)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）及成骨分化。然而，血流模式如何通過分子機(jī)制調(diào)控內(nèi)膜鈣化尚不明確。

BMP/SMAD1/5信號通路是血管鈣化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子，其激活通過促進(jìn)EndMT和成骨基因表達(dá)加速礦物沉積。值得注意的是，KLF2作為層流誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，具有抗炎和血管保護(hù)功能，但其對BMP通路及鈣化的調(diào)控作用未被揭示。既往研究提示，KLF2表達(dá)缺失與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展相關(guān)，而其在鈣化中的功能機(jī)制存在研究空白。這一矛盾現(xiàn)象暗示，KLF2可能通過調(diào)控機(jī)械力-BMP信號軸影響鈣化進(jìn)程。

基于此，香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院在一項(xiàng)研究中，闡明KLF2通過抑制內(nèi)皮BMP/SMAD1/5信號通路介導(dǎo)層流的抗鈣化作用。通過整合臨床數(shù)據(jù)、細(xì)胞力學(xué)模型及基因編輯技術(shù)，發(fā)現(xiàn)KLF2直接結(jié)合BMP4、BMPER和SMAD1啟動(dòng)子，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而阻斷EndMT和磷酸鈣沉積。該機(jī)制不僅解釋了鈣化的空間分布特征，更為KLF2-BMP的治療策略提供了理論依據(jù)，有望突破當(dāng)前以侵入性手術(shù)為主的臨床困境。研究成果發(fā)表于“Circulation research”期刊題為“KLF2 Mediates the Suppressive Effect of  Laminar Flow on Vascular Calcification by  Inhibiting Endothelial BMP/SMAD1/5 Signaling”。

首先，通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈鈣化傾向發(fā)生于血流模式受干擾的動(dòng)脈分支點(diǎn)，提示血流動(dòng)力學(xué)可能決定鈣化分布。為驗(yàn)證這一假說，研究人員招募48例患者行冠狀動(dòng)脈計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影評估。聚焦左冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)，對比分析分叉與非分叉部位鈣化程度（圖1A）。統(tǒng)計(jì)分析明確顯示，鈣化在分叉部位的累積顯著高于非分叉區(qū)域（圖1B-1F）。進(jìn)一步按鈣化評分分組后，所有亞組均一致顯示分叉區(qū)鈣化評分顯著更高。這些結(jié)果證實(shí)血管鈣化在患者中存在位點(diǎn)特異性分布模式，且與血流紊亂密切相關(guān)。

圖1    患者冠狀動(dòng)脈鈣化的部位特異性分布。

然后，由于血流動(dòng)力學(xué)特征與血管鈣化的空間分布密切相關(guān)，層流剪切應(yīng)力（LSS）抑制鈣化，而紊亂流（DF）存在于主動(dòng)脈弓及分支起始部位，與鈣化顯著相關(guān)。為驗(yàn)證這一關(guān)聯(lián)，研究人員通過西方飲食喂養(yǎng)ApoE?/?小鼠20周誘導(dǎo)鈣化模型，骨480熒光成像顯示主動(dòng)脈弓鈣化熒光強(qiáng)度顯著高于降主動(dòng)脈（圖2A）。鈣化優(yōu)先發(fā)生于分支點(diǎn)（腹主動(dòng)脈、頸動(dòng)脈）及主動(dòng)脈弓內(nèi)曲率側(cè)（圖2B-2C），而低剪切應(yīng)力的胸主動(dòng)脈肋間分支點(diǎn)也出現(xiàn)鈣沉積。類似現(xiàn)象在維生素D3過載介導(dǎo)的鈣化模型中重現(xiàn)，提示血流模式對鈣化分布的調(diào)控具有普適性。體外實(shí)驗(yàn)中，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）在Y型流動(dòng)腔室（直段20 dyne/cm2均勻LSS，分叉區(qū)10 dyne/cm2非均勻剪切應(yīng)力）培養(yǎng)顯示，分叉區(qū)鈣沉積顯著，而直段幾乎無鈣化（圖2D-2E）。這表明非均勻剪切應(yīng)力促進(jìn)鈣化，而均勻LSS通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞礦化發(fā)揮保護(hù)作用。

圖2    均勻?qū)恿骷羟辛傻钟茆}化。

臨床分析顯示，鈣化性主動(dòng)脈瓣狹窄患者的瓣膜鈣化灶主要分布于心室側(cè)（此處血流呈單向搏動(dòng)性低剪切應(yīng)力），而主動(dòng)脈側(cè)（無明確流向）鈣化較少，提示局部血流動(dòng)力學(xué)特征與鈣化相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鈣化區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞KLF2表達(dá)顯著低于非鈣化區(qū)（圖3A-3B），且血管鈣化模型中KLF2水平普遍下調(diào)（圖3C）。機(jī)制上，KLF2作為剪切應(yīng)力敏感轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)受血流模式直接調(diào)控，在12 dyn/cm2層流剪切應(yīng)力（LSS）作用下，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的KLF2 mRNA在3小時(shí)內(nèi)快速誘導(dǎo)并持續(xù)高表達(dá)至24小時(shí)（圖3D）；而振蕩剪切應(yīng)力（OSS, 0.5±4 dyn/cm2）則顯著抑制KLF2表達(dá)，大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)LSS組的KLF2水平高于OSS組（圖3E）。這表明KLF2是血流動(dòng)力學(xué)調(diào)控鈣化的關(guān)鍵介質(zhì)。

圖3    流動(dòng)敏感性的KLF2（Krüppel樣因子2）在心血管鈣化中被抑制。

接著，研究人員發(fā)現(xiàn)KLF2沉默通過誘導(dǎo)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）顯著加劇成骨分化和血管鈣化。實(shí)驗(yàn)顯示，KLF2基因敲低導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)變，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣特征?；虮磉_(dá)分析進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)皮標(biāo)志物顯著下調(diào)，而平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)記物及EndMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SNAI1顯著上調(diào)，蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證了上述變化（圖4A）。在成骨培養(yǎng)基（OM）中，KLF2沉默的HUVEC表現(xiàn)出成骨分化標(biāo)志物的異常高表達(dá)（圖4B），同時(shí)骨素680熒光染色和茜素紅染色顯示鈣沉積量顯著增加（圖4C-4F）。這些結(jié)果表明，KLF2缺失通過激活EndMT通路使內(nèi)皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)/成骨表型，直接驅(qū)動(dòng)血管鈣化進(jìn)程，揭示了KLF2在抑制病理性鈣化中的核心作用。

圖4    KLF2（Krüppel樣因子2）的沉默促進(jìn)了內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并加速了內(nèi)皮細(xì)胞中的成骨誘導(dǎo)。

為明確內(nèi)皮KLF2在血管鈣化中的作用，研究人員構(gòu)建了ApoE?/?小鼠內(nèi)皮特異性KLF2敲低模型（KLF2????）。通過尾靜脈注射靶向EC的AAV9至Cas9??/?? ApoE?/?和CDH5-Cre Cas9??/?? ApoE?/?小鼠（圖5A），成功實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮KLF2下調(diào)（圖5B-5C），且內(nèi)皮功能標(biāo)志物NOS3同步下調(diào)。Western飲食喂養(yǎng)18周后，KLF2????組小鼠代謝參數(shù)與對照組無差異，但近紅外鈣示蹤顯示血管鈣化程度顯著增加（圖5D-5E）。主動(dòng)脈鈣含量測定進(jìn)一步證實(shí)KLF2????組鈣沉積升高（圖5F），并伴隨成骨標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)（圖5G）。這些結(jié)果證實(shí)內(nèi)皮KLF2缺失直接促進(jìn)血管鈣化，為臨床中血流紊亂區(qū)域鈣化加劇提供了分子解釋。

圖5    內(nèi)皮細(xì)胞特異性KLF2（Krüppel樣因子2）基因敲低，可增加ApoE?/?小鼠的血管鈣化。

接下來，為驗(yàn)證KLF2作為血管鈣化治療靶點(diǎn)的潛力，研究人員通過AAV9載體介導(dǎo)內(nèi)皮特異性過表達(dá)干預(yù)ApoE?/?小鼠（圖6A）。Western飲食喂養(yǎng)18周后，AAV-CDH5-KLF2組小鼠呈現(xiàn)以下顯著變化，近紅外鈣示蹤顯示血管鈣化區(qū)域減少（圖6B-6C），主動(dòng)脈鈣含量顯著下降（圖6D）；主動(dòng)脈KLF2及其下游保護(hù)因子NOS3表達(dá)上調(diào)（圖6E）；成骨標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)（圖6F）。這些結(jié)果證明內(nèi)皮特異性KLF2過表達(dá)可有效改善血管鈣化，為靶向KLF2的基因治療策略提供了臨床前證據(jù)。

圖6    利用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的、靶向內(nèi)皮細(xì)胞的KLF2（Krüppel樣因子2）過表達(dá)，能夠改善ApoE基因敲除小鼠的血管鈣化。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KLF2通過直接調(diào)控BMP配體與拮抗劑表達(dá)抑制SMAD1/5信號通路。mRNA譜分析顯示，KLF2過表達(dá)顯著下調(diào)BMP2/4/6等促鈣化配體，同時(shí)上調(diào)BMP拮抗劑BMPER（圖7B）。相反，KLF2敲低則增加BMP4/6并抑制BMPER表達(dá)（圖7C）。層流剪切應(yīng)力（LSS）通過KLF2依賴性機(jī)制抑制BMP4并激活BMPER，在體外，LSS處理的HUVEC中BMP4表達(dá)降低而BMPER升高（圖7D-E）；在ApoE?/?小鼠模型中，內(nèi)皮特異性KLF2過表達(dá)同樣降低主動(dòng)脈BMP4并上調(diào)BMPER（圖7G-H）。機(jī)制上，染色質(zhì)免疫沉淀證實(shí)KLF2直接結(jié)合BMP4啟動(dòng)子及BMPER啟動(dòng)子（圖7K-L），通過轉(zhuǎn)錄抑制BMP4和激活BMPER雙重作用阻斷SMAD1/5磷酸化（圖7I-J）。該發(fā)現(xiàn)揭示了KLF2作為機(jī)械力-表觀遺傳樞紐調(diào)控血管鈣化的精確分子路徑。

圖7    KLF2（Krüppel樣因子2）通過調(diào)控BMP4和BMPER，從而抑制BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）/SMAD1/5信號通路的激活。

最后，研究人員分析KLF2通過多層級調(diào)控特異性抑制SMAD1信號通路，RNA測序、qPCR及Western blot證實(shí)，KLF2過表達(dá)選擇性下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）中SMAD1的表達(dá)（圖8A-B）。機(jī)制上，染色質(zhì)免疫沉淀顯示KLF2直接結(jié)合SMAD1啟動(dòng)子（圖8C），降低其轉(zhuǎn)錄活性；同時(shí)減少SMAD1核轉(zhuǎn)位及染色質(zhì)結(jié)合。KLF2敲低則顯著升高SMAD1、p-SMAD1/5水平（圖8D-E），其效應(yīng)與成骨培養(yǎng)基（OM）處理相當(dāng)（圖8F）。功能驗(yàn)證表明，SMAD1基因沉默可wanquan逆轉(zhuǎn)KLF2缺失誘導(dǎo)的成骨標(biāo)志物表達(dá)（圖8G-I），證明SMAD1是KLF2調(diào)控內(nèi)皮成骨分化的核心效應(yīng)因子。

圖8    SMAD1介導(dǎo)了由KLF2（Krüppel樣因子2）沉默所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞成骨分化。

圖9    圖形摘要。

總之，研究揭示了KLF2通過抑制BMP/SMAD1/5信號通路介導(dǎo)層流剪切應(yīng)力（LSS）對血管鈣化的保護(hù)作用。臨床數(shù)據(jù)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致表明，鈣化灶優(yōu)先分布于血流紊亂區(qū)域，而內(nèi)皮特異性KLF2敲除加重鈣化，過表達(dá)則顯著緩解。機(jī)制上，KLF2直接結(jié)合BMP4、BMPER及SMAD1啟動(dòng)子，抑制促鈣化配體表達(dá)并激活拮抗劑。然而，研究存在局限性，瓣膜鈣化中血流紊亂（DF）的具體貢獻(xiàn)仍需量化；KLF2在成骨細(xì)胞中表現(xiàn)促分化功能，與內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用相反，其細(xì)胞類型特異性機(jī)制有待解析；血管平滑肌細(xì)胞分泌的BMP2可能協(xié)同促進(jìn)鈣化，需進(jìn)一步探究KLF2-BMP軸的多細(xì)胞互作。綜上，KLF2-BMP/SMAD1/5通路為靶向血管鈣化提供了新方向，但其跨細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及臨床轉(zhuǎn)化潛力需深入驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：Huang J, Pu Y, Zhang H, Xie L, He L, Zhang CL, Cheng CK, Huo Y, Wan S, Chen S, Huang Y, Lau CW, Wang L, Xia Y, Huang Y, Luo JY. KLF2 Mediates the Suppressive Effect of Laminar Flow on Vascular Calcification by Inhibiting Endothelial BMP/SMAD1/5 Signaling. Circ Res. 2021 Aug 6;129(4):e87-e100. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.120.318690. Epub 2021 Jun 23. PMID: 34157851.

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