血小板反應(yīng)蛋白-1經(jīng)整合素/YAP通路抑鐵死亡緩骨關(guān)節(jié)炎

Thrombospondin-1 mitigates osteoarthritis progression by inhibiting mechanical stress-induced chondrocyte ferroptosis via the integrin/YAP pathway

Keywords: THBS1; chondrocytes; ferroptosis; mechanical stress; osteoarthritis.

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種累及全身關(guān)節(jié)的退行性疾病，尤其好發(fā)于承重關(guān)節(jié)，顯著影響中老年人群的生活質(zhì)量。隨著全球人口老齡化進(jìn)程加速，OA患者數(shù)量持續(xù)攀升，已成為臨床常見病。然而，目前針對(duì)OA的治療藥物主要局限于緩解疼痛癥狀，無法有效阻止關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)行性丟失和退變。因此，深入探究OA的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)，以遏制疾病進(jìn)展，是當(dāng)前亟待解決的重大臨床需求。

異常的機(jī)械應(yīng)力是誘發(fā)和加速OA進(jìn)展的關(guān)鍵因素。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞暴露于超負(fù)荷或異常的機(jī)械應(yīng)力下，可觸發(fā)多種細(xì)胞死亡途徑，包括凋亡、壞死以及近年來備受關(guān)注的鐵死亡。鐵死亡是一種鐵依賴性的、由脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)的新型細(xì)胞死亡方式，其特征是谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）活性受抑，導(dǎo)致活性氧（ROS）積累和細(xì)胞膜磷脂的氧化損傷。研究表明，機(jī)械應(yīng)力可通過激活壓電離子通道等途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，從而加劇軟骨破壞和OA進(jìn)展。

血小板反應(yīng)蛋白-1（THBS1）是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在細(xì)胞-基質(zhì)相互作用和機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演關(guān)鍵角色。它作為整合素的重要配體，其構(gòu)象在機(jī)械應(yīng)力作用下發(fā)生改變，暴露出整合素結(jié)合位點(diǎn)，從而增強(qiáng)與整合素的結(jié)合親和力。在人類OA患者的承重區(qū)域軟骨組織中，THBS1蛋白的表達(dá)水平顯著降低。這提示THBS1表達(dá)下降可能與OA的機(jī)械應(yīng)力損傷和軟骨細(xì)胞死亡密切相關(guān)。因此，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院骨科在一項(xiàng)研究中，深入探討THBS1在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡中的作用及其分子機(jī)制，并評(píng)估THBS1作為延緩OA進(jìn)展的新型治療策略的潛力。研究成果發(fā)表于“Frontiers in immunology”期刊題為“Thrombospondin-1 mitigates osteoarthritis progression by inhibiting mechanical stress-induced chondrocyte ferroptosis via the integrin/YAP pathway”。

首先，研究人員在膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者的軟骨組織樣本中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析揭示了一個(gè)重要現(xiàn)象，與非負(fù)重區(qū)域相比，負(fù)重區(qū)域的THBS1表達(dá)顯著降低（圖1a）。進(jìn)一步的富集分析顯示，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）及其受體相互作用通路在此背景下顯著富集（圖1b）。鑒于THBS1已被報(bào)道在細(xì)胞-ECM相互作用中起關(guān)鍵作用，這一發(fā)現(xiàn)提示THBS1表達(dá)下調(diào)可能與機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨損傷相關(guān)。為驗(yàn)證此關(guān)聯(lián)，分析了OA患者負(fù)重區(qū)與卸載區(qū)的軟骨切片。組織學(xué)染色清晰顯示負(fù)重區(qū)存在嚴(yán)重的軟骨結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為多處軟骨裂隙和蛋白聚糖丟失（圖1c-e）。更重要的是，免疫組織化學(xué)染色證實(shí)了負(fù)重區(qū)軟骨細(xì)胞中THBS1蛋白表達(dá)水平的確降低（圖1f,g）。此外，透射電鏡觀察負(fù)重區(qū)軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了線粒體嵴減少、膜增厚等特征性改變，提示存在鐵死亡跡象（圖1h）。這些結(jié)果共同指向THBS1表達(dá)減少與OA負(fù)重區(qū)軟骨細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力下?lián)p傷的密切聯(lián)系。

圖1    在患有膝骨關(guān)節(jié)炎的病人中，其關(guān)節(jié)軟骨上承受壓力的區(qū)域，THBS1這種蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少了。

然后，為探究THBS1在骨關(guān)節(jié)炎（OA）中的作用，研究人員構(gòu)建腺相關(guān)病毒載體（AAV-THBS1）進(jìn)行關(guān)節(jié)腔過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將30只Wistar大鼠分為對(duì)照組（CON）、AAV-GFP組和AAV-THBS1組，分別注射PBS、AAV-GFP及AAV-THBS1至左膝關(guān)節(jié)腔（圖2a）。注射2周后IVIS檢測(cè)證實(shí)病毒成功遞送（圖2b），4周時(shí)隨機(jī)取樣顯示AAV-THBS1組軟骨組織THBS1轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組（圖2c-e）。12周齡時(shí)建立DMM骨關(guān)節(jié)炎模型，8周后分析顯示，微CT證實(shí)AAV-THBS1組顯著抑制了OA相關(guān)的骨贅增生（圖2f,g）；Safranin O染色揭示該組軟骨破壞程度減輕，OARSI評(píng)分降低（圖2h,i）；IHC分析進(jìn)一步表明THBS1過表達(dá)促進(jìn)合成代謝標(biāo)志物表達(dá)，同時(shí)抑制分解代謝標(biāo)志物（圖2j-n）。這些結(jié)果證實(shí)THBS1過表達(dá)可通過調(diào)控軟骨代謝平衡延緩OA進(jìn)展。

圖2    THBS1保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨并延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。

接著，為闡明THBS1在機(jī)械應(yīng)力下保護(hù)軟骨細(xì)胞的機(jī)制，研究人員建立體外加壓模型（1 MPa）。結(jié)果顯示，異常機(jī)械應(yīng)力可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡，表現(xiàn)為線粒體嵴減少、膜增厚及GPX4表達(dá)下降（圖3i,j）；而添加重組人THBS1（rhTHBS1）能顯著逆轉(zhuǎn)上述改變，恢復(fù)線粒體活性并降低ROS水平（圖3a-h）。同時(shí)，rhTHBS1上調(diào)合成代謝標(biāo)志物和GPX4的表達(dá)，抑制分解代謝因子的轉(zhuǎn)錄與蛋白水平（圖3j-l）。關(guān)鍵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，軟骨特異性GPX4敲除小鼠失去THBS1的骨保護(hù)作用，表現(xiàn)為骨贅增生加劇和軟骨損傷惡化。此外，rhTHBS1同樣可拮抗RSL3引發(fā)的線粒體功能障礙和GPX4抑制。這些結(jié)果證實(shí)THBS1通過調(diào)控GPX4依賴性鐵死亡通路抵抗機(jī)械應(yīng)力損傷。

圖3    THBS1抑制過度機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞鐵死亡。

為闡明THBS1調(diào)控機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制，研究人員通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建THBS1互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其與整合素β1、β3及CD36、CD47等受體存在潛在關(guān)聯(lián)（圖4A）。聚焦細(xì)胞膜受體（圖4B），免疫熒光染色顯示，在機(jī)械應(yīng)力刺激下，THBS1與整合素β1顯著共定位，而與整合素β3、CD36、CD47無共定位現(xiàn)象（圖4C,D）。進(jìn)一步通過Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，THBS1抗體在機(jī)械應(yīng)力條件下可特異性沉淀整合素β1，而在靜態(tài)條件下結(jié)合較弱（圖4E）。該結(jié)果證實(shí)機(jī)械應(yīng)力增強(qiáng)THBS1與整合素β1的直接結(jié)合，為解析其下游信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。

圖4    在機(jī)械應(yīng)力作用下，THBS1與整合素αVβ1之間的相互作用增強(qiáng)。

為驗(yàn)證THBS1是否通過整合素β1通路抑制機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞鐵死亡，研究人員引入整合素β1抑制劑進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，機(jī)械應(yīng)力下rhTHBS1原本可恢復(fù)的細(xì)胞活性（圖5A,B）和線粒體功能（圖5C,D）在整合素抑制后wanquan失效；透射電鏡觀察到抑制劑組線粒體嵴消失、膜破裂等典型鐵死亡特征（圖5E）。同時(shí)，rhTHBS1對(duì)機(jī)械應(yīng)力下ROS清除（圖5F-I）、GSH水平維持（圖5J）以及代謝標(biāo)志物的調(diào)控作用均被抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖5K-N）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)THBS1通過整合素β1依賴的分子機(jī)制調(diào)控GPX4活性及氧化還原平衡，從而抵抗機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖5    THBS1通過整合素αVβ1抑制機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞鐵死亡。

為解析THBS1通過整合素/YAP通路調(diào)控軟骨細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制，研究人員發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力刺激下，敲低THBS1可顯著抑制YAP1的核轉(zhuǎn)位（圖6a-d）；而外源性rhTHBS1通過整合素β1信號(hào)促進(jìn)YAP1核轉(zhuǎn)位及蛋白表達(dá)，該效應(yīng)可被整合素抑制劑阻斷（圖6e-h）。功能驗(yàn)證顯示，YAP1抑制劑可消除rhTHBS1對(duì)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的鐵死亡的保護(hù)作用，表現(xiàn)為線粒體膜電位降低（圖6l,m）、GSH耗竭（圖6n）及線粒體結(jié)構(gòu)損傷（圖6k）。這些結(jié)果證實(shí)THBS1通過整合素β1/YAP1軸增強(qiáng)軟骨細(xì)胞抗氧化能力，維持線粒體穩(wěn)態(tài)以抵抗鐵死亡。

圖6    THBS1通過整合素V1/YAP通路抑制軟骨細(xì)胞鐵死亡。

最后，為評(píng)估THBS1樣肽（ABT-510）的治療潛力，研究人員在小鼠DMM骨關(guān)節(jié)炎模型中開展實(shí)驗(yàn)。術(shù)后給予膝關(guān)節(jié)腔注射ABT-510，8周后分析顯示，Micro-CT證實(shí)ABT-510組骨贅形成顯著減少（圖7b,c）；Safranin O染色顯示關(guān)節(jié)軟骨破壞減輕，OARSI評(píng)分降低（圖7d,e）；IHC分析表明ABT-510促進(jìn)合成代謝標(biāo)志物表達(dá)，抑制分解代謝因子表達(dá)（圖7f-n）。綜上，THBS1模擬肽ABT-510通過調(diào)控軟骨代謝平衡有效延緩OA進(jìn)展。

圖7    研究表明，THBS1樣肽能顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展并保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

圖8    圖片摘要。

總之，研究揭示血小板反應(yīng)蛋白-1（THBS1）通過整合素β1/YAP信號(hào)軸調(diào)控機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞鐵死亡，為骨關(guān)節(jié)炎（OA）治療提供新靶點(diǎn)。機(jī)械應(yīng)力通過激活整合素β1介導(dǎo)THBS1構(gòu)象改變，促進(jìn)其與整合素結(jié)合并激活YAP核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而維持谷胱甘肽（GSH）穩(wěn)態(tài)和GPX4活性，抑制脂質(zhì)過氧化及線粒體損傷。該通路闡明機(jī)械應(yīng)力通過THBS1-整合素β1-YAP-GPX4級(jí)聯(lián)反應(yīng)驅(qū)動(dòng)OA進(jìn)展，靶向該通路通過平衡軟骨代謝有效延緩疾病發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：Wang S, Zhou X, Zhang F, Zhai H, Zhang Y, Guo Y. Thrombospondin-1 mitigates osteoarthritis progression by inhibiting mechanical stress-induced chondrocyte ferroptosis via the integrin/YAP pathway. Front Immunol. 2025 May 22;16:1577234. doi: 10.3389/fimmu.2025.1577234. PMID: 40475787; PMCID: PMC12137073.

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